從40億年前微生物的出現(xiàn)，到單細胞生物，再到脊椎動物，直至我們現(xiàn)在的人類，經(jīng)歷了漫長的進化過程。除了各時期物種形態(tài)上顯而易見的變化外，作為組成一切生命體物質基礎的蛋白質，也在隨著周圍環(huán)境的變化而不斷發(fā)生改變。它們通過結構上的不斷復雜化形成多聚體，可以衍生出各種新的功能，例如配體結合的協(xié)同效應以及變構調節(jié)作用等，從而使生物能夠適應其生存環(huán)境而不被淘汰。那么，絕大多數(shù)蛋白質的多聚體結構及其對應的功能，是如何在進化過程中被衍生出來的呢? 在傳統(tǒng)的認知里，形成多聚體這樣精巧的結構需要復雜的進化過程，一般認為其間經(jīng)歷了多個氨基酸的替換和漫長的選擇，最終才得到形成多聚體的能力。然而，這種觀點又是否正確呢？
為了探索這個問題，近日美國芝加哥大學研究人員選取了血紅蛋白這個體系來進行了深入的分析。血紅蛋白是存在于高等生物紅細胞中介導氧氣運輸和交換的一種蛋白質。在大多數(shù)脊椎動物中，血紅蛋白是由兩個α亞基和兩個β亞基組成的異源四聚體。其中，每個亞基具有與肌紅蛋白相似的結構，即各亞基中的肽鏈都會盤繞折疊成球形，內聯(lián)一個血紅素輔基，通常我們將這種球形結構稱為珠蛋白。
血紅素輔基是血紅蛋白和肌紅蛋白能夠攜氧的關鍵所在。它是由一個卟啉環(huán)和一個鐵原子組成。2價的鐵原子位于卟啉環(huán)中央，它有6個配位鍵，其中4個與卟啉環(huán)平面的N原子結合，兩個與卟啉環(huán)平面垂直，當血紅素輔基垂直插 入肽鏈疏水空腔時，第五個配位鍵將連在珠蛋白肽鏈中第8位的組氨酸殘基的吲哚環(huán)側鏈的氮原子上，這種結構允許鐵通過共價鍵與氧或其他氣體結合在亞鐵血紅素的遠端口袋，以完成6個配體的八面體配位。
血紅蛋白與氧的結合及釋放一個非常神奇的過程：當紅細胞在肺部毛細血管等氧含量高的地方中穿行時，紅細胞中的血紅蛋白能夠快速與氧結合，然后通過血液循環(huán)將氧運輸至全身各處。而當紅細胞經(jīng)過CO2濃度較高的組織時，血紅蛋白又容易與氧分離，然后將氧釋放出來，以保證對各組織的供氧需求。血紅蛋白的這種高效攜氧和釋放氧的現(xiàn)象稱為協(xié)同效應。它與血紅蛋白的四級結構及其構象變化密切相關。血紅蛋白具有T和R兩種狀態(tài)，也就是拉緊狀態(tài)和松弛狀態(tài)：當沒有結合O2時，血紅蛋白主要是T狀態(tài)，這種狀態(tài)下血紅蛋白對O2的親和性很低；而當血紅蛋白中的一個亞基與氧相結合時，所有亞基都會發(fā)生運動，引起四個亞基相對空間位置的變化，使兩個α亞基相互接近，兩個β亞基則遠離，由T狀態(tài)迅速變成R狀態(tài)。這個變化會增加其余亞基對氧的親和力，從而使血紅蛋白在肺中可以迅速與氧結合。反之，當氧合血紅蛋白處于CO2濃度較高的環(huán)境或酸性環(huán)境下時，CO2和H+將充當變構抑制劑，降低血紅蛋白對O2的結合能力，當氧合血紅蛋白的一個亞基發(fā)生解離時，由于構象的變化也會使其余亞基更容易解離。這樣，血液進入氧含量低的組織中時，血紅蛋白就會迅速將氧放出，從而起到高效運輸氧氣的作用。
目前科學家普遍認為，血紅蛋白和肌紅蛋白在很久之前是通過同一個祖先-那時候的血紅蛋白還是保持著單體形態(tài)的，那么它是怎么逐步進化成今天的異四聚體形態(tài)的呢？為了探索血紅蛋白的異源四聚體結構及對應功能的進化起源，研究人員先根據(jù)收集獲得的177條來自脊椎動物（也就是從魚類到哺乳類）的包含血紅蛋白和肌紅蛋白在內的多種珠蛋白代表性序列，繪制了系統(tǒng)發(fā)育樹并重構出了重要節(jié)點的祖先序列：α亞基的祖先蛋白Ancα（圖中粉紅色圓圈所示）、β亞基的祖先蛋白Ancβ（圖中藍色圓圈所示）、α亞基和β亞基共同的祖先蛋白Ancα/β（圖中紫色圓圈所示）以及肌紅蛋白和血紅蛋白的共同祖先蛋白AncMH（圖中紫色圓圈所示）。拿到這些祖先蛋白序列之后，研究人員將他們表達純化出來，并用質譜、排阻色譜和多角度光散射等實驗對它們的組裝方式等特性進行了表征。首先，根據(jù)實驗結果研究人員發(fā)現(xiàn)，將Ancα和Ancβ放在一起共表達時，二者可以形成像現(xiàn)代血紅蛋白那樣的異源四聚體，其解離常數(shù)為10微摩左右，和現(xiàn)代人類血紅蛋白的解離常數(shù)（15微摩）基本一致；而將Ancα和Ancβ單獨表達的話，可以看到Ancα之間只能形成同源二聚體，Ancβ之間形成的是同源四聚體，Ancα/β可以形成同源二聚體結構，但不能組裝成四聚體；而AncMH是一個單體。因此研究人員推測，Ancα/β同源二聚體是介于AncMH單體和現(xiàn)代血紅蛋白異源四聚體之間的中間過渡態(tài)。
接下來，研究人員通過分析這些祖先蛋白的氧結合特性來反應血紅蛋白功能特性的進化。在前面的背景里我們了解到，現(xiàn)代的血紅蛋白能夠通過變構效應協(xié)同性結合或釋放氧。變構調節(jié)分子如六磷酸肌醇（簡稱IHP）等通過結合到血紅蛋白的β亞基中可降低血紅蛋白對氧的親和性。P50是指血紅蛋白氧飽和度為50%時的氧分壓，它是反應血紅蛋白與氧結合親和力的常用指標。當P50減小時，意味著血紅蛋白與氧的親和力增加，氧不易從血紅蛋白中釋放出來；反之當P50值增大時，則說明血紅蛋白與氧的親和力減少。希爾系數(shù)n則是反應各亞基協(xié)同效應的一個指標。研究人員通過對Ancα/β以及Ancα和Ancβ的共表達產(chǎn)物加以IHP處理之后觀察到，Ancα/β組的P50值和希爾系數(shù)均基本無變化，說明Ancα/β不具有變構作用及對應的協(xié)同效應；而Ancα+Ancβ組加入IHP之后，P50和希爾系數(shù)n均增加了，從而可以看出Ancα和Ancβ的共表達產(chǎn)物有著類似現(xiàn)代血紅蛋白的功能。這些實驗結果證實結構與功能之間相互對應的關系，Ancα/β由于缺乏四聚體結構，無法像血紅蛋白那樣能夠協(xié)同結合或釋放氧。從而也再次說明，血紅蛋白的變構作用及協(xié)同效應與形成的異源四聚體密切相關。
血紅蛋白之所以能夠保持四聚體的模樣，是因為有兩個關鍵的界面：IF1和IF2在發(fā)揮著主導作用，其中IF1主要負責連接α1-β1、α2-β2；IF2，IF2z則主要負責連接α1-β2、α2-β1。那么，這兩個界面在進化的過程中到底是哪個先出現(xiàn)，哪個后出現(xiàn)呢，研究人員接下來應用氫氘交換質譜(HDX-MS)技術重點分析了這兩個界面的進化情況。氫氘交換質譜(HDX-MS)技術的主要原理是：暴露在溶劑中的殘基吸收氘的速度比掩埋的殘基快，因此，二聚體界面的肽段在當單體狀態(tài)占主導地位的溶液環(huán)境中會比在二聚體狀態(tài)占主導地位的溶液環(huán)境中表現(xiàn)出較高的氘吸收量。研究人員通過測量含有IF1界面處殘基的肽段（即第106位到111位氨基酸）處的氘吸收量驗證了這個觀點。在b圖中，綠色標注的這條曲線和0.67微摩對應的這條曲線中，絕大多數(shù)的Ancα/β都是處于單體狀態(tài)，而75微摩的溶液環(huán)境中，Ancα/β主要是呈現(xiàn)二聚體形式。從圖中的結果我們可以看到，在偏向形成單體的溶液環(huán)境中氘吸收量遠遠高于偏向形成二聚體的溶液環(huán)境中的氘吸收量。此外，通過測量比較含不同區(qū)域殘基的肽段在0.65μM和75μM溶液中的氘吸收量，研究人員發(fā)現(xiàn)含有IF1界面處的氨基酸殘基對應的肽段在兩種不同溶液環(huán)境中的氘吸收量的差異性是的，而含IF2界面處殘基的肽段其氘吸收量基本無差異。這說明在Ancα/β形成的二聚體中，只存在IF1這個界面，而不存在IF2這個界面，IF1界面對于Ancα/β的二聚體化非常重要。之后研究人員通過突變實驗再次驗證了這個結論，他們發(fā)現(xiàn)，將IF1界面中的殘基突變之后會嚴重損害Ancα/β的二聚化，突變后的Ancα/β全變成了單體狀態(tài)；但突變IF2界面處的殘基時則不會對Ancα/β的寡聚化狀態(tài)產(chǎn)生影響。
因此，研究人員推測，IF1界面是在Ancα/β之前就已經(jīng)存在的，Ancα/β可以通過IF1界面形成二聚體，之后隨著進化的發(fā)展衍生出了IF2界面，后續(xù)β亞基就能通過該界面再由二聚體組裝成四聚體。這一發(fā)現(xiàn)也解釋了為什么前面觀察到的Ancα/β既不具有協(xié)同性也不具有變構調控作用的現(xiàn)象，因為這兩種功能都需要IF2介導組裝成四聚體。
那么，這個有利于介導組裝四聚體的IF2界面是如何進化而來的呢?研究人員接下來通過比較各祖先蛋白的氨基酸差異性，并結合突變實驗找到了答案。通過比對，他們發(fā)現(xiàn)，Ancα/β與Ancα之間只存在3個差異氨基酸，包括一個替換和兩個缺失。而Ancα/β與Ancβ之間存在42個差異氨基酸, 這其中有4個位于IF1界面處，5個位于IF2界面處。接下來，研究人員根據(jù)這些差異氨基酸構造了一系列的突變體。例如，將5個存在于Ancβ的IF2界面處的氨基酸突變回Ancα/β中構成了Ancα/β5這個突變體，將該突變體與Ancα共表達之后，能夠形成同源四聚體也能形成異源四聚體；而將其中4個氨基酸突變回Ancα/β中構成了Ancα/β4這個突變體后發(fā)現(xiàn)，將該突變體與Ancα共表達只能形成同源四聚體。這說明第5個差異氨基酸，也就是h104E對于異源四聚體的形成至關重要。隨后研究人員又挑選了除H104E之外的任意兩個存在于IF2界面處的氨基酸進行突變形成Ancα/β2之后發(fā)現(xiàn)，它們都能形成四聚體。這說明IF2新界面的形成還是很簡單的，只要兩個突變就能實現(xiàn)，沒有想象中的那么復雜。從上面構造的這些突變，我們能夠看到，不管是β5、β4還是β2突變體，他們都不能特異性形成像血紅蛋白那樣的α2β2型異源四聚體，于是他們假設位于IF1界面的4個差異氨基酸對于四聚體的異質性非常重要。通過IF1先形成了異源二聚體，然后再通過IF2接口組裝成四聚體（之前Ancα/β中的都是同源二聚體）。因此，接下來他們在Ancα/β5這個突變體的基礎上再把位于IF1界面上的四個氨基酸也進行了回復突變，形成了Ancα/β9突變體。與預測相一致的是，當Ancα/β9突變體與Ancα共表達時，主要存在的是異源二聚體和異源四聚體這兩種形態(tài)。因為Ancα/β9和Ancα的共表達物的溶解性不是很好，影響了質譜對多聚體結構的定量分析，所以研究人員又把位于界面臨界處的另外5個氨基酸也進行了突變，構成了Ancα/β14突變體，當該突變體與Ancα共表達的時候，其溶解性得到了大大的改善，并且質譜結果表明其主要的形態(tài)是α2β2型異源四聚體。從這可以看出，IF2的出現(xiàn)引起了蛋白的四聚體化，而IF1界面處的差異氨基酸殘基對于異質特異性至關重要。從Ancα/β同源二聚體到血紅蛋白的異源四聚體只需要替換掉位于兩個界面中的少數(shù)幾個氨基酸殘基就能實現(xiàn)。
那么，如此少的氨基酸替換是如何產(chǎn)生一個新的、特定的多聚體相互作用的呢，研究人員接下來探索了新界面形成的結構機制。首先，研究人員利用同源建模獲得的異源四聚體模型，確定了祖先蛋白上介導各界面相互作用的所有有利關聯(lián)。然后結合進化樹，來判斷了這些殘基的進化情況。B圖和C圖分別展示的是存在于IF界面處和IF2界面處的各亞基中氨基酸殘基之間的相互作用。圖中實線表示的是氫鍵，虛線表示的是范德華力。左邊這一列是存在于Ancα/β14亞基（相當于血紅蛋白中的β亞基）中的氨基酸，右邊表示的是Ancα亞基中的氨基酸。每個氨基酸從外到里分別對應的是在AncMH、Ancα/β和Ancα或Ancα/β14中存在的狀態(tài)，因此可以很清楚的看到這些有相互作用的氨基酸的進化情況。例如，圖中黑色標識的這些氨基酸都是從AncMH到Ancα或Ancα/β14中始終保持保守狀態(tài)的一批氨基酸，紅色標識的氨基酸表示的是從Ancα/β時期才開始變化的，而藍色標識的氨基酸則是近期才發(fā)生變化的。從圖中的這些相互作用我們可以看出，不僅是后來變化的氨基酸之間能產(chǎn)生相互作用以促使新界面的生成，之前一些非常保守的氨基酸也會被招募進來發(fā)揮重要的作用。例如：在IF1和IF2界面處，Ancα中的這些能和Ancα/β14產(chǎn)生相互作用的氨基酸從Ancα/β時期就沒有發(fā)生過變化。又如，每個亞基上的R33都能和對面亞基上的F125(苯丙氨酸)形成2個氫鍵，而這兩個氨基酸都是在AncMH之前就已經(jīng)存在的。所以新增的這些氨基酸替換可以在原有這些進化比較早的氨基酸之間的比較弱的相互作用的基礎上，迅速增加多聚體的占位，這也從結構層面上解釋了新界面出現(xiàn)及多聚體形成的原因。
最后，研究人員探究了Ancα+Ancβ的協(xié)同性的進化過程。從前面的結果我們可以看到，Ancα/β中沒有變構效應和協(xié)同性，但Ancα和Ancβ的共表達物卻具備這兩種功能，這是怎么來的呢？我們已知，現(xiàn)代血紅蛋白的協(xié)同性涉及到兩種構象，一種是對氧有高親和性但是IF2界面處的相互作用比較弱的R態(tài)，而另一種是作用正好相反的T態(tài)。協(xié)同性通常是由連接了血紅素輔基和IF2界面的螺旋上一系列的氨基酸殘基所介導的，研究人員將這群氨基酸稱為變構核心區(qū)域。為了了解協(xié)同性產(chǎn)生的進化機制，研究人員檢查了血紅素輔基口袋和變構核心區(qū)域中氨基酸殘基的進化情況。圖A表示的是Ancα+Ancβ通過同源建模獲得的模型，其中這些球形表示的是以血紅素為中心4埃范圍內的位于Ancβ亞基上的氨基酸殘基，不同的顏色表示不同的進化情況，其中灰色表示的是從AncMH之后都沒有發(fā)生變化的殘基，紫色表示的是Ancα/β起開始發(fā)生變化的殘基。從圖中的結果我們可以看到，在已獲得協(xié)同性的蛋白模型中，沒有氨基酸發(fā)生過變化，絕大多數(shù)氨基酸都是在AncMH之前就已經(jīng)獲得的，這其中包括近端組氨酸（深灰色的地方），它能共價結合血紅素鐵，并能將血紅素與氧結合的信息傳導至變構核心區(qū)域和IF2界面處，從而導致其他亞基在低親和和高親和構象之間轉換。在β亞基中，連接組氨酸和IF2界面的螺旋上，有兩個氨基酸發(fā)生了變化，就是圖中黃色標注的那兩個氨基酸。在α亞基中，則沒有變化。這些觀察結果表明，介導血紅素-氧結合位點和IF2之間變構連接的結構性質在Ancα/β中就已經(jīng)存在，它早于協(xié)同性和四聚化出現(xiàn)的進化節(jié)點。其實，在此前就曾有報道稱，許多介導Hb協(xié)同性的構象變化，如血紅素的幾何形狀的扭曲和氧結合時組氨酸和螺旋的運動，就已存在于沒有協(xié)同性且為單體的肌紅蛋白中。這與研究人員提出的觀點是相一致的。
出于這個觀點，研究人員對存在兩個IF2突變的Ancα/β2突變體的氧結合能力進行了表征。正如預測的那樣，Ancα/β2雖然只能形成同源四聚體，但是與Ancα/β的氧親和力相比，Ancα/β2對氧的親和力確實有所下降（這表現(xiàn)為P50值增加了），并且具有顯著統(tǒng)計學差異的協(xié)同性（b圖中各柱形圖上面的示數(shù)就是反應協(xié)同性的希爾系數(shù)）。從這我們不難看出，單獲取四聚體結構就有可能改變蛋白質的氧結合能力，并且能使蛋白質協(xié)同性結合氧。然而，四聚體在高親和力和低親和力狀態(tài)之間轉換的能力對突變很敏感。Ancα/β4和Ancα/β14與Ancα可形成異源四聚體，其氧親和力也降低了，但它們失去了在Ancα/β2中發(fā)現(xiàn)的協(xié)同性。一個可能的解釋是這些蛋白質中額外的突變過分穩(wěn)定了低親和構象。如果是這樣的話，那么從Ancα/β到協(xié)同性復合物Ancα+Ancβ中間必然有一些氨基酸替換在調整了這個平衡，從而使得蛋白可以根據(jù)氧分壓情況而決定T和R構象中哪個應該出場.。當然，目前這些氨基酸的進化先后順序是研究中還沒有解決的問題: 也許IF2上的某些氨基酸替換能夠立即產(chǎn)生具有協(xié)同效應的血紅蛋白樣復合物，就像Ancα/β2那樣。又或者說，協(xié)同性可能是通過像Ancα/β4那樣的低氧親合力的四聚體中間產(chǎn)物而產(chǎn)生的. 至于到底哪個是真實的答案，還有待于后續(xù)的挖掘。
本研究較好的詮釋了血紅蛋白結構及功能的進化起源，同時，它也告訴我們，復雜的分子結構和功能并非都需要經(jīng)歷漫長的漸進軌跡，它也可能是因為少數(shù)一些氨基酸替換“閃亮登場”導致的結果。
參考文獻
Pillai AS, Chandler SA, Liu Y, Signore AV, Cortez-Romero CR, Benesch JLP, Laganowsky A, Storz JF, Hochberg GKA, Thornton JW. Origin of Complexity in Haemoglobin Evolution. Nature. 2020 May;581(7809):480-485. doi: 10.1038/s41586-020-2292-y