背景[1-3]
組蛋白H3.3抗體是一類可以特異性結(jié)合組蛋白H3.3的多克隆抗體，主要用于檢測(cè)組蛋白H3.3的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
檢測(cè)原理：雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中組蛋白H3.3水平。用純化的組蛋白H3.3抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入組蛋白H3.3，再與HRP標(biāo)記的組蛋白H3.3抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的組蛋白H3.3呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中組蛋白H3.3濃度。
組蛋白是真核生物中一類進(jìn)化上相對(duì)保守的蛋白質(zhì)。由組蛋白八聚體及纏繞其上的DNA構(gòu)成的核小體是真核生物染色質(zhì)的基本組成單位。核小體使DNA保持固縮狀態(tài)，既能維持基因組的穩(wěn)定性，又能保證DNA序列可以正確地進(jìn)行復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，重組和修復(fù)。
核小體轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生物過程除了通過組蛋白翻譯后修飾，還可以通過組蛋白研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3變體H3.3與常規(guī)組蛋白H3相比僅有幾個(gè)氨基酸的區(qū)別，但H3.3卻能由特異的分子伴侶介導(dǎo)，整合進(jìn)入染色質(zhì)同時(shí)，H3.3作為一種母源因子在正常受精和體細(xì)胞核移植等細(xì)胞重編程過程中也發(fā)揮著重要作用。
應(yīng)用[4][5]
用于組蛋白H3K14乙?；{(diào)控紫色紫孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的機(jī)制研究
以紫色紫孢菌Ku80敲除菌株為出發(fā)菌株,首先利用同源重組的方法對(duì)組蛋白H3K14位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變,同時(shí)敲除修飾組蛋白H3K14乙?；慕M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶gcn5,之后對(duì)Ku8K敲除菌株和各突變株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢進(jìn)行測(cè)定和比較,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等方法研究組蛋白H3K14乙?；{(diào)控紫色紫孢菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的機(jī)制。
通過以上研究可以初步闡明組蛋白修飾調(diào)控紫色紫孢菌產(chǎn)孢的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.獲得H3K14突變菌株首先獲得H3K14位點(diǎn)突變成R和Q的H3片段,然后酶切質(zhì)粒H3-3’-pPK2-sur-GFP,經(jīng)過In-fusion酶連接將突變片段連接到sur基因的另一端。將構(gòu)建好的突變載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化紫色紫孢菌Ku80菌株,用氯啼磺隆篩選轉(zhuǎn)化子,通過測(cè)序和Western blot的方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。
2. 獲得gcn5敲除菌株首先酶切質(zhì)粒pPK2-sur-GFP,然后經(jīng)過In-fusion酶連接將gcn5上下游同源片段連接到sur基因的兩端。將構(gòu)建好的敲除載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化紫色紫孢菌Ku80菌株,用氯嘧磺隆篩選轉(zhuǎn)化子,通過PCR等方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。
3. 突變株和敲除株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢受到影響Ku80菌株的孢子形成能力相對(duì)高于突變株和敲除株。在所研究培養(yǎng)基上,除PDA培養(yǎng)基外,H3K14Q突變株和gcn5敲除株與Ku80菌株相比生長(zhǎng)速度均降低。然而,在PDA培養(yǎng)基上,H3K14R突變株的生長(zhǎng)速度相對(duì)高于Ku80菌株,并且在其它培養(yǎng)基上沒有顯著變化。
4.各突變株和敲除株的轉(zhuǎn)錄組分析組蛋白的翻譯后修飾會(huì)影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),從而會(huì)影響基因的表達(dá)。
參考文獻(xiàn)
[1]Application methods of Steinernema feltiae,Xenorhabdus bovienii and Purpureocillium lilacinum to control root-knot nematodes in greenhouse tomato systems[J].Ilker Kepenekci,Selcuk Hazir,Ercin Oksal,Edwin E.Lewis.Crop Protection.2018
[2]Gcn5‐dependent histone H3 acetylation and gene activity is required for the asexual development and virulence of Beauveria bassiana[J].Qing Cai,Juan‐Juan Wang,Bo Fu,Sheng‐Hua Ying,Ming‐Guang Feng.Environmental Microbiology.2018(4)
[3]Essential role of Rpd3‐dependent lysine modification in the growth,development and virulence of Beauveria bassiana[J].Qing Cai,Zhi‐Kang Wang,Wei Shao,Sheng‐Hua Ying,Ming‐Guang Feng.Environmental Microbiology.2018(4)
[4]FvSet2 regulates fungal growth,pathogenicity,and secondary metabolism in Fusarium verticillioides[J].Qin Gu,Zhenzhong Wang,Xiao Sun,Tiantian Ji,Hai Huang,Yang Yang,Hao Zhang,Hafiz Abdul Samad Tahir,Liming Wu,Huijun Wu,Xuewen Gao.Fungal Genetics and Biology.2017
[5]韓晶晶.組蛋白H3K14乙?；{(diào)控紫色紫孢菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的機(jī)制研究[D].云南大學(xué),2019.