近日，勃林格殷格翰的乙磺酸尼達(dá)尼布（Nintedanib Esylate，Ofev®）的進(jìn)口上市申請審評完畢，目前處于審批階段，有望在中國獲批用于治療特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）。
從1998年確定靶點、立項，到2014年獲批上市，經(jīng)歷了16年的風(fēng)雨，尼達(dá)尼布終于上市！其獨特的作用機(jī)理讓IPF患者收益良多。2016年Ofev銷售額的同比增長70%，達(dá)6.78億美元。以此增長，預(yù)計Ofev有望于2017年突破10億美元成為IPF領(lǐng)域中的重磅炸彈。市場前景，異常廣闊，勃林格殷格翰的研發(fā)人員功不可沒。那么，研發(fā)過程中尼達(dá)尼布的靶點設(shè)計及路線選擇，對我們有什么借鑒意義呢？
作用靶點
乙磺酸尼達(dá)尼布是一種有效的口服小分子酪氨酸激酶抑制劑，也稱為三重血管激酶抑制劑，抑制血管生成中涉及的三種主要信號通路。乙磺酸尼達(dá)尼布靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR）家族，成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）家族，血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）家族以及Src和Flt-3激酶介導(dǎo)的促血管生成和促纖維化途徑（圖1）。
圖1 尼達(dá)尼布作用靶點
結(jié)構(gòu)與合成
1998年，勃林格殷格翰成立了開發(fā)用于治療癌癥的血管生成抑制劑的優(yōu)化項目。起初，項目的關(guān)鍵目標(biāo)是：選擇性抑制血管內(nèi)皮生長因子2（VEGFR-2）超過其他激酶、有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、良好的口服生物利用度和證明在體內(nèi)腫瘤異種移植物中的活性。研究人員艱苦奮斗，尋尋覓覓，優(yōu)中選優(yōu)，最終篩選出BIBF1120，通用名為乙磺酸尼達(dá)尼布，一種6-甲氧基羰基取代的吲哚酮衍生物（圖2）。
圖2 乙磺酸尼達(dá)尼布
乙磺酸尼達(dá)尼布的合成涉及兩個重要中間體（6）和（9），全合成路線詳見圖3。中間體（6）和（9）合成路線如下：
將4-氯-3-硝基苯甲酸酯（3）和丙二酸酯經(jīng)烴化反應(yīng)得硝基苯類化合物（4），（4）經(jīng)還原、環(huán)化反應(yīng)得吲哚類化合物（5），（5）經(jīng)乙酰化、酯縮合、消除反應(yīng)得中間體（6）。
中間體（9）是一種哌嗪類衍生物，其合成可以采用一鍋法。以N-甲基-4-硝基苯胺為原料，經(jīng)酰化、N-烷基化、催化氫化還原反應(yīng)獲得。
（6）和（9）經(jīng)共軛加成-消除反應(yīng)得尼達(dá)尼布游離堿2（pKa=7.9）。2在甲醇中與乙磺酸經(jīng)成鹽反應(yīng)得乙磺酸尼達(dá)尼布（1）。（1）具有以下理化性質(zhì)：mp=305℃，log P=3.0，高溶解度（水，>20 mg/mL）。
圖3 乙磺酸尼達(dá)尼布合成路線
藥物化學(xué)和構(gòu)效關(guān)系（SAR）
最初，基于高通量篩選出了VEGFR-2抑制劑。同時，相關(guān)激酶項目（CDK4）衍生物的選擇性測試中發(fā)現(xiàn)化合物10（見表1）的VEGFR-2抑制力不強(qiáng)但已具有細(xì)胞活性。并且對另一種近緣激酶CDK4，完全沒有作用，也就是說有很高的選擇性。當(dāng)在小激酶選擇性測試時，化合物10顯示出明顯優(yōu)于其他結(jié)構(gòu)的特異性模式。這種選擇性的可能是因為羥吲哚母核的6位上的取代基。研究人員假設(shè)，這個位置的取代基應(yīng)該占據(jù)ATP結(jié)合區(qū)域的“specificity pocket”（見圖4）。后來該假設(shè)被尼達(dá)尼布的X-射線結(jié)構(gòu)和VEGFR-2的激酶結(jié)構(gòu)域所證實。研究人員認(rèn)為化合物的選擇性是首要條件，抑制活性可以進(jìn)一步優(yōu)選。在這種思路指導(dǎo)下，選擇化合物10作為Lead，進(jìn)一步衍生化研究。
表1 關(guān)鍵化合物10的生物活性
圖4 6-取代氧吲哚的構(gòu)-效關(guān)系
合成的場戰(zhàn)役（synthesis campaign）是得到SAR，提高化合物10的生物活性。圖4顯示了總體的SAR。用較小的烷基取代核糖“pocket”中的中央芳基，不利于分子的化學(xué)穩(wěn)定性，這可能是因為只有苯基部分可以采用垂直于分子其余部分的無應(yīng)變構(gòu)象。這種垂直構(gòu)象破壞了整體平坦的化合物形狀，并且可能是乙磺酸尼達(dá)尼布水溶性好的原因之一。盡管無取代基的化合物11（表1）對于相關(guān)激酶如CDK4，InsR和IGF1R（1μM）顯示出較低的選擇性，但是6位的取代處理可以使化合物良好的進(jìn)入或退出激酶。最有效的變異是6-硝基取代（化合物12，表1），但是因為硝基的誘變性能，放棄。氯取代的化合物如13進(jìn)行了進(jìn)一步研究，但由于選擇性較小，最終終止。
盡管酯取代化合物（如化合物14）是有效的抑制劑，酯酶的代謝降解是一個明顯的風(fēng)險。只有當(dāng)14和衍生物在嚙齒動物中表現(xiàn)出可接受的口服利用度時，才將其進(jìn)一步優(yōu)化。當(dāng)對40個激酶進(jìn)行選擇性測試時，化合物14之類顯示出優(yōu)異的激酶特異性。選擇性測試包括對FGFR和PDGFR的抑制作用，這被認(rèn)為對化合物的整體抗血管生成作用有益。6-羧基氧吲哚（如15）對VEGFR-2，F(xiàn)GFR或PDGFR受體沒有顯示活性。
在R2處優(yōu)化外緣的激酶口袋的芳環(huán)取代，能得到直接的效果。表面的SAR可以微調(diào)細(xì)胞活性和溶解性等性質(zhì)。對于多數(shù)化合物，都能很好地抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖。R2的優(yōu)化得到了一組高效的、有選擇性和口服的化合物，如BIBF1000（16）。表2可以清晰的看出研究人員的優(yōu)化路徑。在評估異種移植實驗（見靶點結(jié)合），化學(xué)制造控制表征，一般藥理學(xué)和耐受性測試（見毒理學(xué)）中進(jìn)行后，2001年完成了優(yōu)化，乙磺酸尼達(dá)尼布（2）進(jìn)入臨床前研究階段。
表2 Lead化合物10的優(yōu)化與結(jié)果
靶點結(jié)合
乙磺酸尼達(dá)尼布的臨床前研究采用體外抑制實驗，證明其明顯的、高選擇性的藥理活性（見表3）。靶點激酶包括所有3個VEGFR亞型，F(xiàn)GFR1、2和3以及PDGFR-α和β。同時靶向這三種不同的促血管生成受體可能會增強(qiáng)其抗腫瘤作用，并克服VEGF-和VEGFR-2靶向藥物抗性。尼達(dá)尼布還抑制Flt-3和Src家族（Src，Lyn和Lck），可能具有治療諸如血液病的潛力。
實驗發(fā)現(xiàn)VEGFR-2轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞暴露于尼達(dá)尼布僅1小時，VEGFR-2的體外抑制持續(xù)至少32h，顯著的抑制靶點激酶。采用臍靜脈（HUVEC）和皮膚微血管（HSMEC）（EC 50 <10 nM）的內(nèi)皮細(xì)胞，證明乙磺酸尼達(dá)尼布抑制VEGF刺激的細(xì)胞增殖。該抑制途徑是通過抑制MAPK和Akt磷酸化。
乙磺酸尼達(dá)尼布還抑制FGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖，PDGF誘導(dǎo)的周細(xì)胞和人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞（HUASMC）。然而，對人上皮癌細(xì)胞系的增殖沒有觀察到抑制作用，沒有檢測到VEGFR，F(xiàn)GFR或PDGFR的表達(dá)。
在一系列體外腫瘤異種移植模型中，乙磺酸尼達(dá)尼布有顯著的抑制活性，包括NSCLC（Calu-6），人腎細(xì)胞癌（RCC）（Caki-1），結(jié)腸直腸（HT-29），卵巢（SKOV-3 ）和前列腺癌（PAC-120）。
在NSCLC（H460）的異種移植物中，乙磺酸尼達(dá)尼布與多西紫杉醇或培美曲塞顯示出協(xié)同效應(yīng)。與多西紫杉醇的組合使腫瘤縮小至僅為對照組的27％，而相同劑量的單用尼達(dá)尼布或多西紫杉醇治療效果差（腫瘤生長抑制率分別為75％和66％）。對Calu-6細(xì)胞尼達(dá)尼布和培美曲塞的組合有相似結(jié)果。
在一系列臨床前研究中評估了乙磺酸尼達(dá)尼布抑制VEGFR，PDGFR和FGFR的抗纖維化作用。乙磺酸尼達(dá)尼布在體外抑制正常人肺成纖維細(xì)胞的PDGFR-α和-β的活性和增殖，并抑制IPF患者和對照供體的PDGF-BB-，F(xiàn)GF-2-和VEGF誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞增殖。
在IPF的兩種不同的小鼠模型中，乙磺酸尼達(dá)尼布有抗炎作用。通過組織學(xué)分析，IPF小鼠模型揭示了乙磺酸尼達(dá)尼布抗纖維化作用是顯著降低肺膠原和纖維化。
表3乙磺酸尼達(dá)尼布體外抑制激酶的活性
非臨床藥物代謝藥代動力學(xué)
使用CD1小鼠，大鼠，獼猴和恒河猴的臨床前毒性研究時，評估了乙磺酸尼達(dá)尼布的PK曲線。大鼠口服生物利用度約為12％，猴子的口服生物利用度為13％～24％（表4）。尼達(dá)尼布在大鼠中不完全吸收，并且有首過代謝。胃酸分泌的抑制對乙磺酸尼達(dá)尼布的吸收沒有影響，鹽酸鹽或乙磺酸鹽具有相似的血漿濃度與時間曲線。
乙磺酸尼達(dá)尼布經(jīng)吸收后，在所有研究的物種中廣泛地分布在組織中，穩(wěn)定狀態(tài)時V（SS）> 8 L/kg（表4）。乙磺酸尼達(dá)尼布具有濃度依賴性，血漿蛋白在50至2000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)結(jié)合，白蛋白是主要結(jié)合蛋白。乙磺酸尼達(dá)尼布的結(jié)合比例，在人血漿中為97.8％，小鼠血漿97.2％，大鼠血漿98.5％。
乙磺酸尼達(dá)尼布的消除，主要是通過酯解和隨后的代謝途徑。同時考慮血漿和排泄物的代謝模式，尼達(dá)尼布的代謝細(xì)分成以下主要反應(yīng)：
（1）將6-取代氧吲哚的甲基酯的酯解；
（2）哌嗪部分的氧化N-去甲基化；
（3）酯解和氧化N-去甲基化。
主要排泄途徑為膽汁代謝產(chǎn)物，經(jīng)口給藥后排泄較少，小鼠藥物相關(guān)放射性劑量為2.1％，尿液排泄量為1.2％。
表4乙磺酸尼達(dá)尼布在部分動物中的PK數(shù)據(jù)
疾病與機(jī)制
目前的抗血管生成藥物的局限性越來越明顯，有效性不足和耐藥性限制了VEGF靶向療法的使用。諸如高血壓、出血、胃腸穿孔的風(fēng)險，皮膚病學(xué)和粘膜炎等毒性也可能限制了VEGF或VEGFR抑制劑的使用。
乙磺酸尼達(dá)尼布作為三種促血管生成途徑受體家族（VEGFR，F(xiàn)GFR和PDGFR）的有效抑制劑，應(yīng)用范圍更廣。
特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種慢性和進(jìn)行性纖維化肺疾病，由于缺乏有效的治療，確診后的中位生存數(shù)只有2-3年。IPF的特征在于成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞不受控制的增殖和分化，以及在肺間質(zhì)和肺泡空間，引起咳嗽和呼吸困難，導(dǎo)致呼吸衰竭。
IPF的致病機(jī)制尚未完全明確，但是乙磺酸尼達(dá)尼布的靶點——許多酪氨酸激酶受體被作為介質(zhì)。FGF-1和FGFR-2在IPF患者肺中的各種細(xì)胞表達(dá)。此外，F(xiàn)GF-2刺激I肺成纖維細(xì)胞增殖，并且抑制FGF信號可以降低肺纖維化，改善IPF小鼠模型的存活率。PDGF造成肌成纖維細(xì)胞的增殖，遷移和存活。VEGF表達(dá)也與哮喘患者的上皮性纖維化相關(guān)，抗VEGF治療在IPF小鼠模型中顯示出一些功能益處。
臨床實驗數(shù)據(jù)
除獲批用于治療IPF外，乙磺酸尼達(dá)尼布還獲歐洲EMA批準(zhǔn)用于治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。IPF的關(guān)鍵3期臨床研究數(shù)據(jù)見表5。
表5 乙磺酸尼達(dá)尼布的IPF關(guān)鍵3期臨床研究數(shù)據(jù)
上市與前景
從啟動新型血管新生抑制劑項目，已經(jīng)超過15年?；ㄙM了大量精力來研究和評估初始化合物，乙磺酸尼達(dá)尼布代表了這一努力的成果，并且在審評階段獲得一定的優(yōu)惠政策，如快速審評通道、優(yōu)先審評、孤兒藥、突破性治療等。下表6為乙磺酸尼達(dá)尼布在美歐日的上市時間。
表6乙磺酸尼達(dá)尼布美歐日上市時間
乙磺酸尼達(dá)尼布具有多個靶點（表7），體內(nèi)活性高。除已獲批特發(fā)性肺纖維化和非小細(xì)胞肺癌2個適應(yīng)癥外，尼達(dá)尼布正在開發(fā)新的適應(yīng)癥，市場前景廣闊，見表7。
表7 尼達(dá)尼布靶點及適應(yīng)癥信息
參考文獻(xiàn)
1. Nintedanib: From Discovery to the Clinic
2. 比癌癥還兇險的致命性肺部疾病迎來新的競爭者，國內(nèi)保衛(wèi)戰(zhàn)即將打響！
3. http://www.pharmaguider.cn/big_data_show.php?id=175