背景^[1-3]

CDCP1抗體是一種可以特異性結(jié)合CDCP1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CDCP1蛋白。CDCP1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

CDCP1，也稱為CD318、TRASK和SIMA 135，是一種135-140 kDa的跨膜蛋白，在細(xì)胞外區(qū)域包含三個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)包含一個(gè)六賴氨酸延伸。MW 80 kDa（p80）的可溶形式在N端側(cè)的未知位點(diǎn)被切割。CDCP1是造血干細(xì)胞的新型標(biāo)志物。

CDCP1抗體

CDCP1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（CDCP1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CDCP1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

CDCP1抗體可以用于CDCP1在肺癌的表達(dá)及RNA干擾對肺癌細(xì)胞生長的影響

在肺癌組織、細(xì)胞系、培養(yǎng)的肺癌干細(xì)胞CDCP1表達(dá)研究的基礎(chǔ)上,探討了CDCP1 RNA干擾對基因的抑制效應(yīng)及對肺癌生長的影響,并初步從細(xì)胞凋亡方面探討了該基因在腫瘤發(fā)展中的作用。

(1) CDCPl在肺癌中的表達(dá)：為探討CDCP1在人類肺癌中的表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性,通過CDCP1抗體免疫組化法檢測了肺腺癌、鱗癌、大細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌中的表達(dá),以正常肺組織、肺良性病變及癌前病變?yōu)閷φ?。CDCP1抗體結(jié)果顯示與正常肺組織、肺良性病變及癌前病變等對照組相比,肺癌組CDCP1表達(dá)顯著增加；CDCP1表達(dá)水平與肺癌病理學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；CDCP1異常表達(dá)主要見于肺腺癌,而肺鱗癌、大細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌異常表達(dá)率低。通過CDCP1抗體細(xì)胞免疫化學(xué)、RT-PCR、免疫印記等方法在體外研究常用肺癌細(xì)胞株也得到相似結(jié)果,即肺腺癌細(xì)胞株A549、SPC-A-1中CDCP1表達(dá)水平較高,而小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H-446表達(dá)水平較低。在證實(shí)CDCP1在肺癌異常表達(dá)研究的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步探討其在肺癌干細(xì)胞的表達(dá)水平,我們首先在體外培養(yǎng)了肺癌十細(xì)胞,通過CDCP1抗體免疫細(xì)胞化學(xué)法初步檢測了CD133干細(xì)胞標(biāo)志物,證明培養(yǎng)微球體的干細(xì)胞特性。在成功的4次培養(yǎng)物中均檢測到CDCP1的表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度存在差異。提示CDCP1也過度表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDCP1在肺癌表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。常用肺腺癌細(xì)胞株A549、SPC-A-1存在CDCP1過度表達(dá),也過度表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞。

(2)CDCP1RNA干擾抑制基因表達(dá)及影響肺癌細(xì)胞生長CDCP1 RNA干擾顯著抑制CDCP1基因的表達(dá)。CDCP1基因沉默的細(xì)胞增殖受到抑制；凋亡細(xì)胞顯著增加；細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase表達(dá)顯著增加。提示CDCP1 RNA干擾顯著影響該基因表達(dá),并通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡等機(jī)制有效抑制腫瘤的生長。通過本研究我們初步證實(shí)CDCP1主要在肺腺癌異常表達(dá)、并與腫瘤的發(fā)展相關(guān)；在肺癌干細(xì)胞中也存在高表達(dá)；干擾CDCP1基因有效抑制肺癌的生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。推測靶向CDCP1可能在腫瘤干細(xì)胞水平發(fā)揮作用。

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