背景[1-3]
anti-Cytochrome c抗體是一類可以特異性結(jié)合人Cytochrome c的多克隆抗體，主要用于檢測人Cytochrome c的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實驗。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人Cytochrome c水平。用純化的人Cytochrome c抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入人Cytochrome c，再與HRP標(biāo)記的人Cytochrome c抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人Cytochrome c呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人Cytochrome c濃度。
Cytochrome c為分散的針狀結(jié)晶，氧化型系花瓣狀結(jié)晶，二者均易溶于水及酸性溶液，前者水溶液呈桃紅色，后者呈深紅色。對熱都較穩(wěn)定。而前者較后者更穩(wěn)定些，分子量約11000-13000。
其作用原理為在酶存在的情況下，對組織的氧化、還原有迅速的促酶作用。通常外源性細胞色素C不能進入健康細胞，但在缺氧時，細胞膜的通透性增加，細胞色素C便有可能進入細胞及線粒體內(nèi)，增強細胞氧化，能提高氧的利用。
臨床上用于各種組織缺氧急救的輔助治療，如一氧化碳中毒、催眠藥中毒、氰化物中毒、新生兒窒息、嚴(yán)重休克期缺氧、腦血管意外、腦震蕩后遺癥、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困難和各種心臟疾患引起的心肌缺氧的治療。
應(yīng)用[4][5]
用于Sirt3介導(dǎo)的COX乙酰化在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡中的作用研究
多亞基的細胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase,COX)是線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV,在電子傳遞過程中發(fā)揮重要作用。與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的老年退行性疾病和缺血/再灌注的細胞凋亡過程中均發(fā)現(xiàn)COX活性降低。但是目前并不清楚細胞凋亡是否與COX乙酰化狀態(tài)升高有關(guān)。
據(jù)此,將考察Sirt3與COX乙酰化水平的關(guān)系,并進一步探討其在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用。首先,研究Sirt3對COX乙?；接绊?。采用30 m M Sirtuin家族抑制劑—尼克酰胺(nicotinic acid amide,NAM)作用于小鼠胚胎成纖維細胞(NIH/3T3)3 h后,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)觀察Sirt3蛋白表達和COX乙酰化水平變化。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sirt3蛋白表達明顯減少,COX乙?；斤@著增加。利用50 n M、100 n M si RNA干擾Sirt3后,利用紫外分光光度計檢測COX的活性,根據(jù)IP分析COX亞基的乙?；礁淖?WB檢測凋亡相關(guān)蛋白。
結(jié)果也顯示COX活性明顯受到抑制,且COX的各亞基中COX-1乙?；教禺愋陨?其余各亞基乙?；阶兓幻黠@。此外,Cyt c釋放到胞漿中增加,Caspase 3被激活,引起NIH/3T3細胞凋亡。
參考文獻
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[4]Exploring the entrance of proton pathways in cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans:Surface charge,buffer capacity and redox-dependent polarity changes at the internal surface[J].Kristina Kirchberg,Hartmut Michel,Ulrike Alexiev.BBA-Bioenergetics.2012
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