背景及概述[1][2]
4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是一種重要的氫離子緩沖劑，其在pH為6.8～8.2的范圍內(nèi)具有良好的緩沖能力，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH。使用濃度為10～50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸即可具有良好的緩沖能力，且對(duì)細(xì)胞無毒性作用。
4-羥乙基哌嗪乙磺酸
應(yīng)用[3]
羥乙基哌嗪乙磺酸的其它應(yīng)用也比較廣泛。專利CN201310477071.6公開了一種利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸作為模板劑制備了多孔氧化鋅微球的方法。該法操作簡(jiǎn)單，所制備的微球尺寸均勻，具有多級(jí)孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，可用于生產(chǎn)催化劑和氣敏元件。專利CN201080052103.2將4-羥乙基哌嗪乙磺酸及其衍生物用于治療癌癥疼痛和抑制化療后的副作用。
羥乙基哌嗪乙磺酸是動(dòng)物源和人源細(xì)胞培養(yǎng)中的緩沖液常用組分。研究已經(jīng)證實(shí)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸在所有已知的緩沖液中具有最小的細(xì)胞毒性。FDA(美國(guó)食品和藥物管理局)已經(jīng)批準(zhǔn)基于哌嗪的兩性離子分子可作為食品添加劑。
具體應(yīng)用：
4-羥乙基哌嗪乙磺酸對(duì)金槍魚肽黃嘌呤氧化酶抑制劑的增強(qiáng)作用，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
(1)在37℃條件下配制150mM，pH值7.4的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、Tris-HCl、PB緩沖液，4℃保藏，待用；
(2)用上述150mM的緩沖液配制所需樣品(金槍魚肽)，樣品濃度為40mg/ml；
(3)在96孔酶標(biāo)板中依次加入50μL金槍魚肽或50μL緩沖液(空白)、150μL黃嘌呤，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，37℃保溫5min后加入50μL黃嘌呤氧化酶，30s讀數(shù)一次吸光值，總計(jì)50次25min。讀數(shù)完后以80μL的HCl終止反應(yīng)，取反應(yīng)液以相應(yīng)緩沖液稀釋10倍，過0.25μm水性膜，待測(cè)尿酸濃度；
(4)高效液相色譜法測(cè)定反應(yīng)后樣品中尿酸的含量，以尿酸標(biāo)準(zhǔn)品定量；
(5)計(jì)算黃嘌呤氧化酶抑制率，計(jì)算方法如下：
I＝(CB-CS)/CB×100％
式中：I表示黃嘌呤氧化酶抑制率，CB為空白組(不加多肽)反應(yīng)后液相圖譜尿酸峰的峰面積，CS表示樣品組(加多肽)反應(yīng)后液相圖譜尿酸峰的峰面積。
本方法中金槍魚肽制備工藝流程為：將金槍魚魚肉攪碎按料液質(zhì)量比1：1加去離子水混合，調(diào)節(jié)pH值至7.0，按金槍魚質(zhì)量的0.6～1.2％分別加入復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶，在50～60℃條件下酶解4～7小時(shí)，酶解結(jié)束后升溫至95℃保溫15min滅酶，冷卻后離心，取上清液濃縮后噴霧干燥即得金槍魚肽。
在4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，Tris緩沖液和PB緩沖液中，黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產(chǎn)生的尿酸含量幾乎沒有差異，而HEPES能夠顯著性地提高金槍魚多肽的黃嘌呤氧化酶抑制率，這一結(jié)果表明4-羥乙基哌嗪乙磺酸可起到增強(qiáng)多肽黃嘌呤氧化酶抑制活性的作用。
制備[2]
將0.5mol N-羥乙基哌嗪和0.525mol 2-羥乙基磺酸鈉和500mL去離子水加入帶回流管的1000mL四口燒瓶中，在充分?jǐn)嚢柘逻M(jìn)行縮合反應(yīng)；先在60℃下反應(yīng)1.0小時(shí)，然后逐漸升溫沸騰回流，并繼續(xù)反應(yīng)2.0小時(shí)；然后降溫得到含4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉的反應(yīng)母液。經(jīng)高效液相色譜分析，計(jì)算得到4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉的產(chǎn)率為88.4％。
將含0.5mol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉，質(zhì)量濃度為40wt％的反應(yīng)母液置于1000mL燒杯中，在攪拌作用下，緩慢滴加46.5g濃鹽酸(37wt％)，然后在常溫下攪拌酸化1小時(shí)。然后向?yàn)V液中加入5g活性炭脫色。抽濾后的濾液用去離子水稀釋到2wt％的濃度經(jīng)納濾透析除去氯化鈉；最后經(jīng)蒸發(fā)濃縮得到的4-羥乙基哌嗪乙磺酸粗品，最后用500ml無水甲醇洗滌三次，并經(jīng)真空干燥得到高純度4-羥乙基哌嗪乙磺酸。
主要參考資料
[1] 崔洪友, 朱麗偉, 王建剛, 劉然升, 楊涌, & 王楊. (2017). 利用納濾制備高純度4羥乙基哌嗪乙磺酸的方法.
[2] 梁紅波, 張偉, 吳濤, 沈江南, 張榮強(qiáng), & 吳建平. (2016). 雙極膜電滲析制備有機(jī)酸——以羥乙基哌嗪乙磺酸為實(shí)例. 過濾與分離(2), 8-11.
[3] 蘇國(guó)萬, 何偉煒, 趙謀明, & 孫東曉. (0). 4-羥乙基哌嗪乙磺酸在黃嘌呤氧化酶抑制肽中的應(yīng)用.