丙酮酸羧化酶（PC)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定 

測(cè)定意義：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、霉菌和酵母的線粒體中，催化 丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，是糖異生過(guò)程的第一個(gè)限速酶，在保證血糖的動(dòng)態(tài)平 衡方面起著重要的作用。 

測(cè)定原理：

PC 催化丙酮酸、ATP、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和 NADH 生成蘋果酸和 NAD+，在 340nm 下測(cè)定 NADH 氧化速率，即可反映 PC 活性。

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本前處理： 

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1ml 提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。 

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。 

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 PC（此步可選做）。 

5、 在步驟④的沉淀中加入 1ml 提取液，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 PC 活性測(cè)定。

測(cè)定步驟： 

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。 工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其 它物種)預(yù)熱 5 分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 試劑四的配制：在試劑四瓶中加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍 融。

2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑四和 180μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。 注意：在該試劑盒中，若ΔA 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使ΔA 小于 0.5 可提高檢 測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。