【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應用于核酸RNA的快速擴增。

【檢測原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術開發(fā)的恒溫核酸擴增檢測試劑，在42℃恒溫條件下特異識別并擴增目標樣本的RNA片段，可用Genchek 熒光檢測儀實時監(jiān)控擴增過程，5-20 min 即可完成擴增檢測。

【技術原理】重組酶介導鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴增技術。 RT-RAA先利用逆轉錄酶將 RNA 逆轉錄成 cDNA，從細菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結合，形成重組酶/引物復合體，侵入RNA-cDNA雙鏈核酸模板，在侵入位點重組酶將雙鏈打開，同時單鏈結合蛋白結合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復合體開始對雙鏈進行掃描，當引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補序列時，重組酶/引物復合體解體，DNA聚合酶結合到引物的3’端，開始合成新鏈。成的新鏈又可 以作為模板，最終擴增產(chǎn)物以指數(shù)級增長，完成靶標基因的擴增。經(jīng)過熒光標記的探針與擴增產(chǎn)物結合，當探針被核酸外切酶酶切后發(fā)出熒光信號，可對擴增過程進行實時監(jiān)控。本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強等優(yōu)點，反應組分已混合并冷凍干燥成反應干粉，操作簡便，易于保存。

【引物設計與探針設計】

引物設計建議方法：RAA核酸擴增技術對引物設計的要求與常規(guī)PCR引物設計有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個核酸目標物的上下游核苷酸序列；引物長度在30-35nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復序列和內(nèi)部二級結構區(qū)；引物Tm值不作為設計時主要考慮因素；最佳引物對需通過試驗優(yōu)化篩選得到，要求其擴增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴增和明顯的引物二聚體。

探針設計建議方法：探針序列不與引物識別位點重疊，長度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結構和連續(xù)的重復堿基；共有四個修飾位點，距離 5’端的≥35 nt的中部位置標記一個 dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點；THF 位點的上游標記一個熒光基團，下游標記一個淬滅基團，兩個基團的間距為 2-4 nt，THF 距離3’末端≥15nt；在3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團、生物素、生物素-TEG 或 C3-spacer。

建議：在開展 RT-RAA （熒光型）擴增反應之前，先進行引物的篩選試驗， 以便得到較高的檢測靈敏度

【產(chǎn)品組成】

【儲存條件及有效期】本產(chǎn)品存儲于-20±5℃、干燥、避光條件下；有效期為12 個月。

【適用儀器】Genchek系列熒光檢測儀、其他熒光定量 PCR 儀（如：ABI 7500實時熒光定量 PCR儀（軟件要求 2.0

以上）、 Bio-Rad CFX96 Touch 熒光定量 PCR儀或耶拿 qTOWER實時熒光定量 PCR儀等）。

【檢測步驟】

1. RNA樣本提取：請參考傳統(tǒng) Trizol 方法或其他同效商品化試劑盒提取RNA樣本。

2. 樣本檢測

2.1 單管反應體系（50μL）：                     推薦反應體系（模板用量為5μL）：  

反應干粉          1 管                           反應干粉          1 管           

A Buffer          25 μL                         A Buffer          25 μL           

上游引物(10 μM)  2.0 μL                        上游引物(10 μM)  2.0 μL           

下游引物(10 μM)  2.0 μL                        下游引物(10 μM)  2.0 μL           

探針(10 μM)        0.6 μL                     探針(10 μM)      0.6 μL             

RNA樣本和水    17.9μL                           水                12.9 μL          

B Buffer          2.5μL                          RNA樣本          5 μL           

B Buffer         2.5μL           

 總體積         50.0μL          

總體積          50.0μL                                               

2.2 操作步驟

2.2.1 根據(jù)反應數(shù)量，按照反應體系配制含有水、A Buffer、上游引物(10μM)、下游引物(10μM) 、探針（10μM）的 Mix，混合均勻后加入裝有反應干粉的檢測單元管中；

2.2.2 向檢測單元管中加入經(jīng)步驟1處理得到的待測RNA樣本；

2.2.3 再向檢測單元管蓋上加入2.5 μL 的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5-6次，低速離心10 sec； （注：本步驟“是否充分混勻”將決定實驗結果的重復性）

2.2.4 將檢測單元管放入 Genchek 熒光檢測儀中，開始檢測（或其他熒光定量 PCR儀）。

3. RAA 程序設定

3.1 Genchek 系列熒光檢測儀：

3.1.1 開機自檢后，點擊“擴增”；

3.1.2 放入反應管后點擊“新建”，編輯實驗名稱，然后選擇熒光通道“FAM”并選擇相應反應孔。點擊“啟動”；

3.1.3 對反應孔對應的樣本信息進行編輯，完成后點擊“確定”啟動反應。

3.2 其他熒光定量PCR儀：反應體系為50μL體系，熒光通道選擇FAM 通道。

【結果分析與判定】

1. 結果分析

1.1 Genchek系列熒光檢測儀：無需自行設定基線和閾值。

1.2 其他熒光定量 PCR儀：參照具體熒光定量 PCR儀使用說明書進行基線設定和閾值設定。

2. 結果判定

2.1 Genchek 熒光檢測儀：可自動判讀檢測結果。

2.2 其他熒光定量 PCR儀（注：不同熒光定量 PCR儀的判定標準有所差別，可依據(jù)實際情況進行調(diào)整，以下判定內(nèi)容

僅供參考）：

2.2.1 陽性對照：有典型的擴增曲線出現(xiàn)，出峰時間≤15min（Ct值≤30），為有效結果；

2.2.2 陰性對照：無擴增曲線出現(xiàn)，或出峰時間≥20min（Ct值≥40），為有效結果；

2.2.3 檢測樣本：有典型的擴增曲線出現(xiàn)，出峰時間≤18min（Ct值≤36）時為陽性；出峰時間＞18min（Ct值＞36）時為陰性。

【注意事項】

1. 在同一核酸提取方法下，不同樣品類型所提取的核酸含量和純度會有明顯差異，導致擴增效率不同；

2. 當實驗室環(huán)境、試劑、儀器或配件存在陽性物質(zhì)（例如質(zhì)粒、擴增產(chǎn)物等）污染，或樣本間存在交叉污染的情況，則會影響檢測結果準確性，出現(xiàn)假陽性結果；

3. 務必保證試劑保存、配制或運輸?shù)卯?，否則可能導致試劑檢測性能下降，出現(xiàn)假陰性結果；

4. 請嚴格按照本說明書和基因擴增實驗室的管理規(guī)范進行試驗操作；

5. 實驗結束后，檢測過程中所產(chǎn)生的廢棄物應按照相關規(guī)范進行處理。

相關產(chǎn)品：