培養(yǎng)基OPTI-MEM

一、實驗概述

本文旨在總結(jié)利用無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM進行貼壁細胞（如CHO細胞）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的實驗步驟、個人經(jīng)驗以及常見問題分析。通過遵循本指南，實驗者可以更有效地進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，提高轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率。

二、實驗材料

1. 宿主細胞：CHO（貼壁細胞）
2. 脂質(zhì)體：LIPOFECTAMINE 2000（Invitrogen公司）
3. 細胞培養(yǎng)板：6孔細胞培養(yǎng)板
4. 無血清培養(yǎng)基：OPTI-MEM（GIBCO）
5. 轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒

三、實驗步驟

1. 細胞接種：轉(zhuǎn)染前一天，以適當?shù)募毎芏龋ㄈ?_{4×10^5/ml）接種到6孔培養(yǎng)板上。轉(zhuǎn)染時，細胞應達到90}95%的融合。

2. 制備溶液：

   • 溶液1：240μl OPTI-MEM + 10μl LIPOFECTAMINE 2000（總體積250μl），溫育5分鐘。
   • 溶液2：Xμl OPTI-MEM + 4μg 質(zhì)粒（總體積250μl）。

3. 混合溶液：將溶液1與溶液2混合，室溫下靜置20分鐘。

4. 細胞準備：將6孔板中的細胞用OPTI-MEM沖洗兩遍后，加入2ml OPTI-MEM。

5. 加入轉(zhuǎn)染復合物：將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板輕輕混勻。在37℃，5%的CO2中保溫5~6小時。

6. 更換培養(yǎng)基：6小時后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)48~72小時以檢測轉(zhuǎn)染水平。

7. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（可選）：如需進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，換全培養(yǎng)基培養(yǎng)后24小時，以1：10或更高的稀釋比例接種到新的培養(yǎng)板，加抗生素進行篩選。

四、個人經(jīng)驗分享

1. 細胞狀態(tài)：確保細胞處于最佳生長狀態(tài)，避免使用傳代過多的細胞。
2. 細胞融合度：細胞融合度需達到90%以上以確保轉(zhuǎn)染效果。
3. 無血清培養(yǎng)基選擇：OPTI-MEM優(yōu)于PBS或無血清的DMEM，可提高轉(zhuǎn)染效率。
4. 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒質(zhì)量：確保質(zhì)粒純度高、濃度高、無內(nèi)毒素。
5. 轉(zhuǎn)染時間：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)時間不宜過長，以避免對細胞產(chǎn)生毒性。

五、常見問題分析及解決方案

1. 細胞死亡：
   • 可能原因：細胞對OPTI-MEM敏感或細胞狀態(tài)不佳。
   • 解決方案：嘗試使用其他無血清培養(yǎng)基或調(diào)整細胞狀態(tài)。
2. 轉(zhuǎn)染效率下降：
   • 可能原因：細胞接種后培養(yǎng)時間過長，導致細胞對轉(zhuǎn)染不敏感。
   • 解決方案：確保細胞在接種后24小時左右進行轉(zhuǎn)染，以保證細胞處于對數(shù)生長期。
3. 轉(zhuǎn)染試劑毒性：
   • 可能原因：LIPOFECTAMINE 2000毒性較高。
   • 解決方案：考慮更換其他轉(zhuǎn)染試劑或調(diào)整轉(zhuǎn)染條件。

六、經(jīng)驗推薦

• OPTI-MEM相較于PBS和無血清的DMEM培養(yǎng)基，具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
• 在制備轉(zhuǎn)染復合物時，使用無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM可提高轉(zhuǎn)染效率。
• 轉(zhuǎn)染后應及時更換含有血清的全培養(yǎng)基，以避免無血清培養(yǎng)基對細胞產(chǎn)生毒性。

遵循本指南中的實驗步驟和建議，實驗者可以更有效地進行貼壁細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，提高轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率。

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