在免疫系統(tǒng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞猶如訓(xùn)練有素的特種兵，精準(zhǔn)識(shí)別并清除被病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，是宿主防御機(jī)制中的關(guān)鍵力量。今天Elabscience將介紹效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞的分型檢測(cè)方法，助力科研人員深入探究免疫反應(yīng)的機(jī)制！
一、背景介紹
作為T(mén)細(xì)胞的一個(gè)主要亞群，細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+ T細(xì)胞）在宿主防御病毒感染和清除腫瘤細(xì)胞等免疫反應(yīng)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。在免疫反應(yīng)中，初始CD8+ T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別抗原提呈細(xì)胞（如DC細(xì)胞）表面的MHC I-抗原肽類(lèi)復(fù)合物并被激活。進(jìn)而分化為效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞。效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性并分泌多種細(xì)胞因子。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同、細(xì)胞毒性的強(qiáng)弱以及功能的不同，效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞可細(xì)分為不同的效應(yīng)亞型，其中主要的三類(lèi)效應(yīng)亞型為：
Tc1細(xì)胞（Type 1 Cytotoxic T Cells）：主要分泌分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為T(mén)-bet，通過(guò)IFN-γ激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌（如結(jié)核分枝桿菌）和病毒的清除能力。可促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)，是抗腫瘤免疫的核心效應(yīng)細(xì)胞。
Tc2細(xì)胞（Type 2 Cytotoxic T Cells）：主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，IL-4/IL-13可激活嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，幫助清除蠕蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)。
Tc17 （Type 17 Cytotoxic T Cells）：主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等細(xì)胞因子，IL-17促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集，對(duì)抗白色念珠菌、金黃色葡萄球ju等。過(guò)度活化的Tc17可促進(jìn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等自身免疫疾病。
那么在研究中，我們?nèi)绾螛?gòu)建TC1/TC2/TC17細(xì)胞模型并對(duì)這些效應(yīng)亞型進(jìn)行鑒定呢？在此，小E老師為大家提供TC1/TC2/TC17效應(yīng)亞型的體外誘導(dǎo)及鑒定方案。
二、實(shí)驗(yàn)方案
A. 樣本處理：
1) 將小鼠斷脊椎處死后浸泡在酒精中，拿至細(xì)胞房進(jìn)行樣本處理。制備單細(xì)胞懸液：在70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)（底部可以稍微懸空）上研磨小鼠脾臟，以預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，300×g，離心5 min。
2) 用1 mL 分選buffer將脾臟細(xì)胞重懸，細(xì)胞懸液用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾于2 mL EP管，稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108 cells/mL。
B. 初始 CD8+T細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)步驟：
1) 取1 mL細(xì)胞懸液，加入10 μL的FC封閉抗體和10 μL抗體混合物。室溫孵育10 min。加入磁珠100 μL，室溫孵育5 min。加入分選buffer到2.5 mL。
2) 使用磁力架進(jìn)行磁吸2.5 min。拿起磁極，以一個(gè)連續(xù)的動(dòng)作翻轉(zhuǎn)磁極和試管，傾倒富集的細(xì)胞懸液至一個(gè)新的試管中。計(jì)數(shù)離心后使用PBMC培養(yǎng)基重懸。
C. 初始 CD8+T細(xì)胞分選后流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟：
3) 對(duì)未分選細(xì)胞懸液以及分選后上清細(xì)胞懸液進(jìn)行染色。取100 μL樣品，每管加入CD8/CD62L/CD44/CD3抗體各5 μL，4℃孵育30 min。
4) 加1 mLPBS，混勻，300×g離心5 min，去上清，加200 μL PBS重懸，直接上機(jī)檢測(cè)。
D. 上機(jī)操作：停止條件設(shè)置為采集90 μL細(xì)胞懸液，閾值FSC-H大于4000，分析陽(yáng)性T+細(xì)胞群比例即為分選純度。
E. 活化誘導(dǎo)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞：
1) 用完全培養(yǎng)基（自備）將樣本制備成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為 1-2×10 6 /mL。 注：細(xì)胞密度不可過(guò)高，最大密度不超過(guò) 2×10 6個(gè)/mL，細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)影響細(xì)胞的激活效率；關(guān)注細(xì)胞狀態(tài)，對(duì)于新鮮制備的原代細(xì)胞，先觀察確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)良好后再誘導(dǎo)檢測(cè)。
2) 加入對(duì)應(yīng)的單抗和蛋白進(jìn)行刺激誘導(dǎo)72 h。
加入CD3/CD28磁珠活化IL-6(50 ng/ml)
IL-2(8 ng/ml)
TGF-β(3 µg/mL)
加入CD3/CD28磁珠活化IL-4(20 ng/ml)
IL-2(8 ng/ml)
anti-IFN-γ(5 µg/mL)
F. Tc1/Tc2/Tc17細(xì)胞檢測(cè)方案：
1) 每1 mL 細(xì)胞懸液中，加入 2 μL 的 500×Cell Stimulation MIX，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞0.5-1 h；
2) 每1 mL 細(xì)胞懸液中，加入1 μL 1000×Protein Transport Inhibitor MIX，于 37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育5-6 h。
3) 收集細(xì)胞，300×g離心5 min，棄去上清液。每組加180 μL PBS重懸細(xì)胞，按照Fixation Buffer：樣本=1:3的比例加入60 μL Fixation Buffer，輕輕吹打混勻，4°C靜置過(guò)夜固定或室溫固定1小時(shí)。
4) 固定后的細(xì)胞會(huì)沉降至EP管底部，不用離心，小心吸棄部分上清（避免吸到細(xì)胞），加入1-2 mL 1× Permeabilization Buffer，輕輕吹打混勻，500×g離心5 min，棄上清。注：液體盡量吸棄干凈，不要有殘留，吸棄上清時(shí)不要吸到細(xì)胞沉淀。
5) 各組加入100 μL 1× Permeabilization Buffer重懸細(xì)胞沉淀，每組直接加入對(duì)應(yīng)抗體，室溫避光孵育60 min（每15-20min混勻一次）。
6) 孵育完成后，各組加入1-2 mL PBS，輕輕吹打混勻，500×g離心5 min，棄上清。
7) 各組加入100-200 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀，流式上機(jī)檢測(cè)。
G. 上機(jī)操作：停止條件設(shè)置為采集90 μL細(xì)胞懸液，閾值FSC-H大于4000，分析Tc1（CD3+CD8+IFN-γ+）、Tc2（CD3+CD8+IL-4+）、Tc17
（CD3+CD8+IL-17A+）細(xì)胞群比例。
染色方案如下：
三、結(jié)果展示
圖1. Mouse naïve CD8+T細(xì)胞分選前后結(jié)果
圖2. 對(duì)照組和誘導(dǎo)組進(jìn)行Tc1/Tc2/Tc17流式檢測(cè)
四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
五、核心應(yīng)用場(chǎng)景
1. 腫瘤免疫治療：
2. 感染性疾病：
病原體特異性免疫評(píng)估：
Ø Tc1主導(dǎo)抗病毒免疫。
Ø Tc2通過(guò)IL-4協(xié)調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞應(yīng)答。
Ø Tc17通過(guò)IL-17激活中性粒細(xì)胞防御。
疫苗開(kāi)發(fā)：評(píng)估疫苗誘導(dǎo)的Tc1記憶細(xì)胞形成（如mRNA疫苗）。
3. 自身免疫病研究：
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多發(fā)性硬化（MS）患者腦脊液中Tc17浸潤(rùn)與疾病活動(dòng)度正相關(guān)。
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類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）中Tc1/Tc17失衡促進(jìn)關(guān)節(jié)破壞。
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靶向IL-17A（司庫(kù)奇尤單抗）可抑制Tc17的致病作用。
4. 移植免疫監(jiān)測(cè)
六.效應(yīng)CD8+T細(xì)胞分型檢測(cè)Elabscience®相關(guān)試劑推薦：
Mouse CD3/CD28 T Cell Activation Beads
Elab Fluor® Violet 450 Anti-Mouse CD8a
Elab Fluor® 488 Anti-Human/Mouse CD44
PE/Cyanine7 Anti-Mouse IL-17
以上就是效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞分型檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方案及應(yīng)用介紹，如有相關(guān)問(wèn)題歡迎留言！我們將繼續(xù)帶來(lái)T細(xì)胞檢測(cè)干貨，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注~