背景^[1-3]

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒采用的是雙抗體夾心法酶聯免疫吸附檢測技術（ELISA）。測定樣品中人白介素17(IL-17)水平。向預先包被了抗人白介素17(IL-17)抗體的酶標孔中，加入標準品和樣本，溫育后，加入生物素標記的抗白介素17A抗體。再與HRP標記的鏈霉親和素結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入顯色底物TMB，產生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。最后，在450 nm處測定反應孔樣品吸光度（OD）值，樣本中的人白介素17(IL-17)濃度與OD值成正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中人白介素17(IL-17)的濃度。

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

2.血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒操作步驟：

1、標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

20ng/L 5號標準品150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

10ng/L 4號標準品150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

5ng/L 3號標準品150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

2.5ng/L 2號標準品150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

1.25ng/L 1號標準品150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

2、加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4、配液：將30倍（48T的20倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30倍（48T的20倍）稀釋后備用

5、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6、加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7、溫育：操作同3。

8、洗滌：操作同5。

9、顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10、終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11、測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

應用^[4][5]

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒可以用于白介素17（IL-17）在大腸埃希菌誘導的新生大鼠敗血癥中的意義

建立新生大鼠大腸埃希菌敗血癥模型,分析細胞因子IL-17在肺、肝組織中的表達以及血漿中水平的變化,來探討IL-17在新生大鼠敗血癥中的作用及機制,進一步了解淋巴細胞分泌的細胞因子工L-17和巨噬細胞表面CD163在炎癥反應中的作用,通過其表達水平的變化了解機體的免疫狀況。

方法：選用7日齡無特定病原體(SPF級)的Sprague-Dawley(SD)大鼠84只,雌雄不限,質量16-20g,分為兩組,即對照組和敗血癥組,每組42只。所有動物按照隨機原則分入實驗后第2、4、6、8、12、24、48小時7個時間點,每個時間點均為6只新生SD大鼠。敗血癥組采用腹腔注射大腸埃希菌(E.coli)方法來建立新生大鼠敗血癥模型；對照組則用采用腹腔注射等量生理鹽水的方法來建立新生大鼠對照組模型。對照組和敗血癥組分別于設定的七個時間點麻醉動物,心臟采血,取肺臟和肝臟固定于福爾馬林中備用。用人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒檢測血漿中IL-17在各個時間點的水平,用免疫組織化學分析的方法檢測肺組織、肝組織IL-17的表達。

人白介素17(IL-17)Elisa試劑盒結果：1.對照組新生大鼠血漿中IL-17和肺組織、肝組織IL-17各時間點表達水平均無顯著性差異(P>0.05)；2.敗血癥組新生大鼠血漿中IL-17的表達水平,隨著實驗時間的延長而逐漸升高,至12小時左右達高峰,一直延續(xù)到48小時；3.敗血癥組新生大鼠肺組織中IL-17的表達,隨著時實驗間的延長,于12小時左右達到高峰,實驗至48小時一直處于較高水平；4.敗血癥組新生大鼠肝組織IL-17的表達,在實驗至4小時,肝組織中IL-17水平較高,隨后水平稍下降,但實驗至12小時左右再次達到較高的水平,至實驗48小時一直維持在較高水平；5.實驗進展至2小時,敗血癥組新生大鼠血漿中IL-17水平和肺組織、肝組織中IL-17的表達分別與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)；實驗進展至4小時始,敗血癥組新生大鼠血漿中IL-17水平和肺組織、肝組織中IL-17的表達分別高于對照組水平,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

參考文獻

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