背景[1-3]
哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒是一種專門用于提取哺乳動物基因組DNA的試劑盒，通常采用經(jīng)典的蛋白酶K處理法，可以抽提到100-150kb以上的基因組DNA。
使用哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒，可以方便、快速、高效地提取哺乳動物基因組DNA，為后續(xù)的分子生物學(xué)實驗、基因組學(xué)研究、遺傳學(xué)分析等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒的使用方法比較簡單，一般按照試劑盒說明書上的操作步驟進(jìn)行即可。需要注意的是，在進(jìn)行實驗前，需要準(zhǔn)備足夠的試劑和設(shè)備，保證實驗的順利進(jìn)行。同時，還需要注意實驗安全和衛(wèi)生，避免交叉污染和意外事故的發(fā)生。
哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒是一種用于提取哺乳動物基因組DNA的試劑盒。這種試劑盒通常包含多種酶和緩沖液，可以有效地從哺乳動物組織或細(xì)胞中提取高質(zhì)量的DNA。
該試劑盒適用于各種哺乳動物，包括人類、小鼠、大鼠、牛、豬等。它可以用于研究哺乳動物的基因組結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化關(guān)系等方面。此外，該試劑盒還可以用于制備PCR反應(yīng)所需的DNA模板，進(jìn)行基因表達(dá)分析、基因突變檢測等實驗。
哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒
哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒的實驗步驟一般包括以下幾步：
準(zhǔn)備樣品：收集哺乳動物的細(xì)胞、組織或血液等樣品，用液氮進(jìn)行迅速冷凍并儲存?zhèn)溆谩?/p>
細(xì)胞消化：使用細(xì)胞消化試劑，如蛋白酶K等，將細(xì)胞分解成單個核，以便后續(xù)的DNA提取。
細(xì)胞洗滌：用生理鹽水或PBS洗滌細(xì)胞，去除雜質(zhì)和未消化的細(xì)胞碎片。
DNA提?。菏褂肈NA提取試劑，如酚-氯仿等，將DNA從細(xì)胞中提取出來。
DNA沉淀：通過加入無水乙醇或異丙醇等試劑，使DNA發(fā)生沉淀，便于后續(xù)的實驗操作。
DNA洗滌：用70%乙醇或無水乙醇洗滌DNA沉淀，去除殘留的試劑和雜質(zhì)。
DNA溶解：將DNA沉淀溶解在適量的TE緩沖液或水中，以便后續(xù)的分子生物學(xué)實驗或基因組學(xué)研究。
應(yīng)用[4-5]
哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒可以用于DNA N6-mA去甲基酶ALKBH1調(diào)控小鼠外周神經(jīng)元軸突再生能力的研究
通過對ALKBH1表達(dá)的調(diào)控,觀察其對成熟神經(jīng)元細(xì)胞軸突再生能力的影響,并進(jìn)一步分析ALKBH1通過改變基因組DNA N6-m A甲基化水平,影響神經(jīng)元細(xì)胞軸突再生能力的分子機(jī)制,揭示了一種新的調(diào)控軸突再生能力的方向。
方法:本研究課題通過對不同細(xì)胞中基因組DNA的斑點印跡實驗,印證DNA N6-m A這種表觀遺傳調(diào)控方式在哺乳動物神經(jīng)元細(xì)胞中的存在。并且使用哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒提取的基因組DNA的甲基化水平受到去甲基酶ALKBH1和甲基轉(zhuǎn)移酶N6AMT1的調(diào)控。利用RNAi技術(shù),通過體外DRG感覺神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)及電穿孔轉(zhuǎn)染和體內(nèi)DRG電穿孔轉(zhuǎn)染相應(yīng)的si RNA,分別敲低ALKBH1和N6AMT1,以及同時敲低后,觀察ALKBH1和N6AMT1對神經(jīng)元軸突在體內(nèi)和體外再生能力的作用。利用公共數(shù)據(jù)庫GEO中人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)庫(GSE16089)進(jìn)行GO Analysis,探尋敲除ALKBH1后基因表達(dá)的差異性。并選取部分神經(jīng)分化調(diào)節(jié)基因(GO:0045664)作為目標(biāo)基因,利用定量實時PCR探測這些基因在不同條件下(對照組、ALKBH1敲除組,N6AMT1敲除組及ALKBH1+N6AMT1共敲除組)的表達(dá)程度,探究基因組DNA N6-m A水平變化后,對神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響,揭示ALKBH1調(diào)控成熟神經(jīng)元軸突再生能力的機(jī)制。
結(jié)果:(1)ALKBH1在使用哺乳動物基因組DNA抽提試劑盒哺乳動物感覺神經(jīng)元中調(diào)節(jié)DNA的N6-m A甲基化水平:不同細(xì)胞基因組DNA的斑點印記實驗表明,DNA N6-m A存在,并可被N6-m A特異性抗體檢測到;其信號的強(qiáng)度與N6-m A的濃度正相關(guān)。敲低去甲基酶ALKBH1后,N6-m A水平顯著升高(p<0.01);敲低甲基轉(zhuǎn)移酶N6AMT1后,N6-m A水平與對照組相比沒有明顯變化;但共敲除ALKBH1和N6AMT1后,N6-m A水平比單獨(dú)敲除ALKBH1降低(p<0.05),與對照組無顯著差異。
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