背景^[1][2]

葡萄球菌是常見(jiàn)的化膿性菌，廣泛分布于空氣、土壤、水及物品表面，也常存在于人和動(dòng)物的皮膚和鼻咽、腸道。大部分不致病，少數(shù)引起人和動(dòng)物化膿性感染。該菌呈球形，直徑為0.4～1.2μm，平均0.8μm。在固體培養(yǎng)基中，菌體呈多個(gè)平面分裂繁殖，堆積成葡萄狀，故而得名。在膿汁及液體培養(yǎng)基中，菌體可在一個(gè)平面上分裂，成雙或呈鏈狀排列。無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢，一般不形成莢膜。

革蘭染色陽(yáng)性，衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬后菌體革蘭染色陰性。有兩種抗原： 蛋白抗原 (完全性抗原) 和多糖抗原 (半抗原)。葡萄球菌抵抗力很強(qiáng)，80℃30min可被滅活，干燥的膿汁、痰、血液中可存活數(shù)月，50g/L的石炭酸、1g/L的升汞中10～15min死亡。龍膽紫液能抑制生長(zhǎng)。對(duì)磺胺類(lèi)藥物的敏感性低，對(duì)青霉素、紅霉素、金霉素和慶大霉素敏感，對(duì)鏈霉素中度敏感，對(duì)氯霉素敏感性差。

表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis) 是葡萄球菌屬 37 個(gè)家庭成員之一，因其基因組具有高度多態(tài)性和可變性，導(dǎo)致表皮葡萄球菌耐藥菌株的產(chǎn)生呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，甚至出現(xiàn)了多重耐藥。尤其值得注意的是，醫(yī)源性表皮葡萄球菌分離株普遍具有甲氧西林耐藥性，可占其臨床分離株的 75%～90% 。

表皮葡萄球菌的生物膜形成了抗生素的滲透屏障，能保護(hù)菌體免受抗生素的破壞，是重要的防御結(jié)構(gòu)。表皮葡萄球菌生物膜作為葡萄球菌感染的主要致病因素，可阻礙抗生素的滲透、增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性及抵御宿主免疫系統(tǒng)的作用，從而導(dǎo)致慢性或亞急性、持續(xù)性感染。因此，針對(duì)性的對(duì)表皮葡萄球菌生物膜感染相關(guān)因子進(jìn)行深入研究，有利于為臨床開(kāi)展相關(guān)治療提供一些理論支持。

耐藥性^[2]

研究發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌含有 mecA 基因，該基因可編碼青霉素結(jié)合蛋白( penicillin binding protein，PBP) ，其可降低菌株對(duì)甲氧西林的敏感性，因此特別容易產(chǎn)生甲氧西林耐藥株。然而，這種耐藥性一般都比較低，這是因?yàn)楸砥て咸亚蚓哪退?性是異質(zhì)性耐藥( hetero-resistance) ，意味著在 104 ～ 108 個(gè)細(xì)胞中，才會(huì)有一個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)出耐藥性，其余的細(xì)胞都表現(xiàn)為敏感，這與金黃色葡萄球菌出現(xiàn)甲氧西林耐藥性的幾率類(lèi)似。

此外，表皮葡萄球菌出現(xiàn)氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)及克林霉素類(lèi)耐藥性的幾率更低。雖然近年來(lái)臨床分離到的萬(wàn)古霉素耐藥株的比例一直在不斷上升，但還未見(jiàn)到關(guān)于萬(wàn)古霉素強(qiáng)耐藥株出現(xiàn)的相關(guān)報(bào)道。對(duì)新型抗生素而言，耐利奈唑胺及鏈陽(yáng)性菌素抗生素的耐藥株十分罕見(jiàn)，且未見(jiàn)耐達(dá)托霉素和替加環(huán)素的相關(guān)報(bào)道。

生物膜功能^[2]

與大多數(shù) CNS 一樣，表皮葡萄球菌能形成生物膜，且其導(dǎo)致的感染大都與生物膜的形成密切相關(guān)。 細(xì)菌的生物膜是嵌入到細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白吸附層與黏附其上的細(xì)菌簇形成的復(fù)合體，它構(gòu)成了抗生素的滲透屏障，能保護(hù)菌體免受抗生素的破壞，因此是細(xì)菌的重要防御結(jié)構(gòu)，需要使用高濃度抗生素才能殺滅附著在其上的病原菌。

對(duì)于不同的抗生素及宿主防御機(jī)制而言，生物膜行使的保護(hù)機(jī)制可能是不一致的：

①細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于免疫細(xì)胞而言是一個(gè)難以逾越的機(jī)械屏障。如表皮葡萄球菌的生物膜一旦形成，就可在極大程度上影響嗜 中性粒細(xì)胞吞噬作用的正常發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌的生物膜可在一定程度上抵御環(huán)丙沙星的殺菌作用。并且，由于生物膜可有效抑制抗生素的滲透，一定程度上幫助了耐藥菌株的形成。

②細(xì)菌一旦形成生物膜，就表明其在一定程度上進(jìn)入生理性“休眠期”，表現(xiàn)為許多活躍的細(xì)胞活動(dòng)如細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)合成或 DNA 復(fù)制頻率都大幅度下降。生物膜的這一特殊“能力”可顯著削減抗生素的功效，如各種蛋白質(zhì)合成的抑制劑、影響細(xì)胞壁合成的 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的作用顯著減弱。

③生 物膜可“滯留”所謂的“耐藥性”細(xì)胞，從而一定程度上提高了細(xì)菌的耐藥性。如研究發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌生物膜中就含有大量的耐藥菌。

④生物膜可通過(guò)過(guò)表達(dá)相關(guān)蛋白或其它胞外聚合物以增強(qiáng)細(xì)胞的耐藥性。表皮葡萄球菌生物膜除了能抵御抗生素的滲透，幫助耐藥株的形成外，還能抵御宿主的免疫系統(tǒng)，特別是先天性免疫系統(tǒng)的作用。如細(xì)胞外生物膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)的主要生物學(xué)功能就是降低宿主的免疫應(yīng)答，抑制吞噬細(xì)胞的吞噬作用。研究顯示，表皮葡萄球菌生物膜可通過(guò)阻止 C3b 及免疫球蛋白 G( IgG) 的富集導(dǎo)致補(bǔ)體的失活，來(lái)抵御嗜中性粒細(xì)胞的殺傷作用的。

致病因子^[2][3]

正常情況下，表皮葡萄球菌是定植在皮膚和黏膜上的共生菌，為人體含量最多的葡萄球菌。流行病學(xué)研究顯示，正常人攜帶的表皮葡萄球菌菌株 數(shù)量為10～24株。表皮葡萄球菌成為最常見(jiàn)的假 體周?chē)腥局虏【脑驗(yàn)椋孩俦砥て咸亚蚓鷱V泛定植在所有人群的黏膜上皮；②表皮葡萄球菌可以形成生物膜并定植在生物材料表面，形成抗生素耐藥和免疫逃逸；③表皮葡萄球菌群體可以形成有機(jī)整體，通過(guò)群體感應(yīng)功能調(diào)節(jié)進(jìn)一步適應(yīng)周?chē)h(huán)境變化。

這些因素增加了假體表面表皮葡萄球菌感染的預(yù)防和治療難度。由于不同細(xì)菌亞型克隆的黏附材料表面、形成生物膜、免疫逃逸、對(duì)抗治療的毒力因子和調(diào)節(jié)毒力因子等方式有所不同，因此進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，在分子或基因水平闡明細(xì)菌種類(lèi)和分型，進(jìn)而研究感染機(jī)制，對(duì)感染控制和治療有深遠(yuǎn)意義。

有學(xué)者對(duì)表皮葡萄球菌進(jìn)行基 于測(cè)序分析的多位點(diǎn)序列分型研究，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的假體周?chē)腥九R床分離株是ＳＴ２和ＳＴ２１５，這可能與這些細(xì)菌高度多重耐藥性和生物膜形成有關(guān)。雖然表皮葡萄球菌的核心基因序列與金黃色葡萄球菌相似，但缺乏毒力因子和致病島。

生物膜的形成包括以下三個(gè)階段：初始黏附、細(xì)胞增殖聚集和成熟及分離。表皮葡萄球菌初始黏附在非生物體的表面，如生物體內(nèi)留置醫(yī)療設(shè)備的塑料表面，或粘附在生物表面，如組織或人類(lèi)基質(zhì)蛋白覆蓋的設(shè)備表面。

然后，通過(guò)一系列基質(zhì)蛋白和非蛋白聚合物實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖聚集。根據(jù)菌種及環(huán)境條件的不同，細(xì)菌增殖時(shí)可形成或疏松或致密的生物膜結(jié)構(gòu)，成熟的生物膜在外部沖擊力或內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制等作用下可部分脫落，遇到合適的表面可再次黏附形成新的生物膜，此過(guò)程對(duì)細(xì)菌持續(xù)性感染及播散到其它定植部位具有重要作用。在生物膜形成感 染的整個(gè)過(guò)程中，多種分子在其中發(fā)揮了重要的作用。

1. 微生物表面識(shí)別粘附基質(zhì)分子

某些微生物表面識(shí)別粘附基質(zhì)分子(MSCR-AMMs)(MSCR-AMMs) 在表皮葡萄球菌定植于組織或基質(zhì)蛋白覆蓋的留置醫(yī)療設(shè)備表面時(shí)發(fā)揮重要作用。雖然它與生物膜最終形成并沒(méi)有直接的關(guān)系，但它參與了表皮葡萄球菌的定植和感染過(guò)程，這對(duì)病原菌能否長(zhǎng)期在機(jī)體內(nèi)存活而最終導(dǎo)致感染密切相關(guān)。 表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌一樣，有一大類(lèi)參與細(xì)胞定植的 MSCＲAMMs 蛋白，針對(duì)不同的基質(zhì)蛋白，不同的家族成員發(fā)揮各自的作用。

通過(guò)定植而實(shí)現(xiàn) 感染的步對(duì)表皮葡萄球菌意義重大，如表皮葡萄球菌 MSCＲAMMs 蛋白可實(shí)現(xiàn)與纖維蛋白原 ( fibrinogen，SdrG/Fbe) ，纖維連接蛋 白( fibronectin，Embp) ，玻連蛋白( vitronectin，AtlE/Aae) 及膠原蛋白的結(jié)合。其中，纖維蛋白原與纖連蛋白結(jié)合蛋白是 MSCＲAMMs 的狹義代表，它們可通過(guò)分選酶催化作用而共價(jià)鍵錨定到肽聚糖上，發(fā)揮粘附素(adhesins) 的作用。

而玻連蛋白 AtlE 和 Aae 除了行使其基本的翻轉(zhuǎn)細(xì)胞壁的功能外，還可以非共價(jià)鍵 錨定到細(xì)胞壁上發(fā)揮自溶素( autolysins) 及粘附素的功能。此外，膠原蛋白 GehD 作為一種脂肪酶，也可發(fā)揮蛋白黏附的功能。

2. 細(xì)胞間多糖黏附素

表皮葡萄球菌細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為細(xì)胞間多糖黏附素 (PIA) ，也可稱(chēng)之為聚-N-乙酰葡萄糖胺 PNAG) ，由于其可直接介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，被認(rèn)為是 最重要的黏附分子。

雖然還不能確定 PIA 的某些突變體是否存在部分 N-琥珀?；?，但非?？隙ǖ氖谴蠖鄶?shù) PIA 的胞外多糖是線性的 N-乙酰葡萄糖胺聚合物并伴有部分的脫 N-乙酰胺基化，且其平均鏈長(zhǎng)為 130 個(gè)氨基酸。值得注意的是，蛋白鏈中糖基部分以 β1-6 鍵鏈接，這與自然界、幾丁質(zhì)中含量 豐富的多聚葡萄糖胺的 β1-4 鍵不同。在臨床分離到的表皮葡萄球菌菌株中發(fā)現(xiàn)了 PIA 聚合物，自此確定了其在生物膜形成過(guò)程中的重要作用。

3. 磷壁酸磷壁酸( Teichoic acids，TA)

TA是革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌特有的細(xì)胞表面成分，由核糖醇和丙三醇?xì)埢?jīng)磷酸鍵連接而成。根據(jù)其在細(xì)胞表面上的存在方式，可分為連接到細(xì)胞膜的脂磷 壁酸( lipoteichoic acids，LTA) 及以共價(jià)連接到肽聚糖的壁磷壁酸 ( wall teichoic acids，WTA) 兩種形式。

其由丙三醇磷壁酸單元( glycerol phosphate units) 組成，其中丙三醇的第 2 位被 α-葡萄糖、α-葡糖胺、D-丙氨酸或 α- 6-D-丙氨酰-葡萄糖所取代。TA 在表皮葡萄球菌生理、病理過(guò)程中扮演著重要角色，如 TA 可顯著提高纖連蛋白的粘附力。

4. Aap

1997 年，Hussain 等描述了一種相對(duì)分子質(zhì)量為 140 kDa 細(xì)胞外蛋白，并證實(shí)了其對(duì)表皮葡萄球菌在 生物體及非生物體表面聚集的重要作用。這種蛋白 質(zhì)被稱(chēng)之為聚集相關(guān)蛋白( accumulation-associated protein，Aap) 。研究表明，Aap 介導(dǎo)表皮葡萄球菌細(xì)胞間的黏附。但是，只有部分細(xì)胞表達(dá)此種蛋白，而另外一些卻不表達(dá)，這種差異性表達(dá)模式的相關(guān)機(jī)制尚不明確。

Aap 的形成是鋅依賴(lài)性的，并且是通過(guò)所謂的 G5 結(jié)構(gòu)域的二聚化及 G5 結(jié)構(gòu)域串聯(lián)的模式來(lái)完成的。值得關(guān)注的是，Aap 需經(jīng)過(guò)蛋白水解處理，才能形成其活性形態(tài)。除了介導(dǎo)細(xì)胞間黏附外，最新研究表明Aap 還可通過(guò)它的 A 末端結(jié)構(gòu)域使表皮葡萄球菌粘附到人角質(zhì)細(xì)胞上，從而完成在皮膚上的定植，Aap 同時(shí)還是促進(jìn)表皮葡萄球菌非 PIA 依賴(lài)型生物膜形成的最重要因素。

5. Embp 細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白 ( extracellular matrixbinding protein，Embp)

相對(duì)分子質(zhì)量為 1MDa 的巨大共價(jià)連接表面蛋白。它的功能區(qū)是一個(gè)大小 為 460 kDa 的蛋白鏈，可促進(jìn)表皮葡萄球菌非 PIA 依賴(lài)型生物膜的形成。此外，Embp 還可介導(dǎo)纖連蛋 白的粘附作用，參與生物膜形成的粘附和積聚。

 6. Bap /Bhp 生物膜相關(guān)蛋白 ( biofilm-associated protein，Bap)

是表皮葡萄球菌表面蛋白的新成員，是一個(gè)分子量大小為 239 kDa 的表面蛋白，其參與了表皮葡 萄球菌生物膜的黏附和聚集。Bap 在表皮葡萄球菌菌株中普遍存在，它的基因序列中存在一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子，可形成一個(gè)移動(dòng)的致病島。若敲除 Bap 基因，則可有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。此外，Bap 的同源蛋白Bhp，與Bap 具有很高的相似性，可出現(xiàn)在一些表皮葡萄球菌菌株上，同樣在生物膜形成的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

7. PAMs

雖然已有多位研究者對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中的聚集階段進(jìn)行了深入研究，但對(duì)其成熟分離的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不完全。在銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌中，具有不同化學(xué)性質(zhì)的分子表面活性劑( 鼠李糖脂和脂肽) ，分別參與了生物膜的形成。最新研究表明，表皮葡萄球菌的 PSM-β 肽是表皮葡萄球菌生物膜的重要組成部分，這與鼠李糖脂在綠膿桿菌上的作用類(lèi)似。表皮葡萄球菌 PSM-β 缺失突變株的全身性擴(kuò)散能力顯著低于野生菌株，證實(shí)了 PSM-β 肽在細(xì)菌剝離劑擴(kuò)散中的重要作用。

8. 聚-γ-谷氨酸 聚-γ-谷氨酸( Poly-γ-glutamic acid，PGA)

是經(jīng)由谷氨酸的 γ-羧基將谷氨酸殘基連接起來(lái)形成的線性寡聚物。因此嚴(yán)格來(lái)說(shuō) PGA 是一種肽的類(lèi)似物。已在多種微生物特別是嗜鹽菌中發(fā)現(xiàn)了 PGA，并認(rèn)為其主要在細(xì)菌的滲透過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用。雖然在表皮葡萄球菌中，PGA 由大致等量的 D-谷氨酸和 L-谷氨酸組成。

但所有形式的 PGA( 100% 的 D-谷氨酸、100% 的 L-谷氨酸及兩者的混合物) 在自然界不同的生物體中均有發(fā)現(xiàn)。利用表皮葡萄球菌的 cap 同源變株研究發(fā)現(xiàn)，PGA 可保護(hù)其免受 AMPs 及嗜中性粒細(xì)胞的殺傷，且 PGA 還與表皮葡萄球菌小鼠體內(nèi)留置醫(yī)療設(shè)備感染相關(guān)。值得注意的是，當(dāng) PIA 和 TA 部分參與生物膜的形成而抵御對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的防御作用時(shí)，PGA 便不會(huì)在生物膜的形成過(guò)程中發(fā)揮作用 。

主要參考資料

[1] 呼吸系統(tǒng)病學(xué)詞典

[2] 劉玉文; 蔣長(zhǎng)斌. 表皮葡萄球菌生物膜致病相關(guān)因子概述. 標(biāo)記免疫分析與臨床, 2015, 22.6: 586-589.

[3] 沈?yàn)? & 張先龍. (2016). 表皮葡萄球菌引起假體周?chē)腥镜纳锬ば纬蓹C(jī)制. 國(guó)際骨科學(xué)雜志, 37(2), 93-97.