背景[1-3]
HLEC細(xì)胞是襯覆于淋巴管內(nèi)表面的一種單層扁平上皮，是構(gòu)成淋巴管壁的主要結(jié)構(gòu)，參與維持體液平衡，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞再循環(huán)和機(jī)體的免疫反應(yīng)和組織液及蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，在疾病過程中也起著重要作用。近年研究表明，人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞還在傷口愈合、淋巴管水腫和炎癥擴(kuò)散等病理過程中起重要作用，而且與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
內(nèi)皮細(xì)胞系指血管、淋巴管的內(nèi)膜上皮將內(nèi)腔面覆蓋的細(xì)胞。多數(shù)是單層扁平上皮屬中胎葉性的上皮。血液循環(huán)和組織中大單核的游走的吞噬細(xì)胞有人認(rèn)為是來自增生的血管內(nèi)皮。
人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分離自淋巴管組織；淋巴管是淋巴液流經(jīng)的管道。最小的淋巴管稱毛細(xì)淋巴管，起始于盲端。人體除中樞神經(jīng)、表皮、眼球的晶狀體、角膜和內(nèi)耳以外，全身都有分布。淋巴毛細(xì)管逐級匯合形成小、中、大淋巴管，最后形成兩條總淋巴管：右淋巴導(dǎo)管和胸導(dǎo)管。
前者收集右半胸、右側(cè)上肢和頭頸右側(cè)半的淋巴入右側(cè)靜脈角，后者收集下肢、腹部、左半胸、左側(cè)上肢和頭頸左側(cè)半的淋巴入左側(cè)靜脈角。淋巴管中途還通過淋巴結(jié)。淋巴管壁薄，壓力低。毛細(xì)淋巴管的壁為單層扁平內(nèi)皮細(xì)胞，通透性大。大淋巴管壁有平滑肌，受交感神經(jīng)支配，能作主動(dòng)收縮。淋巴管內(nèi)有瓣膜，能防止淋巴倒流。局部淋巴管因病變而阻塞時(shí)，組織液積聚，可出現(xiàn)局部水腫。
應(yīng)用[4][5]
用于Fucoidan下調(diào)HLEC細(xì)胞中VEGFR3和PROX1的表達(dá)抑制淋巴管新生及機(jī)制研究
在淋巴管新生的過程中,淋巴管特異性標(biāo)志物同源異形盒蛋白(PROX1)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體3(VEGFR3)為主要調(diào)節(jié)因子。同源轉(zhuǎn)錄因子PROX1調(diào)控胚胎發(fā)育過程中淋巴管系統(tǒng)的發(fā)育和分化,維持淋巴管系統(tǒng)形成。激活VEGFR3及其配體血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C),誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LECs)的增殖和遷移,并調(diào)節(jié)淋巴管新生。
NF-кB/PI3K/Akt信號通路主要促進(jìn)細(xì)胞粘附,增殖,轉(zhuǎn)移和細(xì)胞外基質(zhì)降解,通路上的靶蛋白的激活,對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有促進(jìn)的作用。利用實(shí)驗(yàn)室前期工作純化后的fucoidan,以人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞HLEC細(xì)胞系為研究對象,采用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及動(dòng)物腫瘤模型探究fucoidan對腫瘤淋巴管新生的抑制作用,并且深入研究fucoidan抗淋巴管新生的作用機(jī)制和相關(guān)信號通路。
方法:1.mtt法檢測fucoidan對hlec細(xì)胞生長活力的影響,fucoidan對hlec細(xì)胞周期的作用是通過流式細(xì)胞術(shù)檢測,westernblot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cdk4和cyclind1的表達(dá)水平。
2. 采用transwell小室法檢測fucoidan對hlec遷移能力,并且利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測fucoidan對不同時(shí)間點(diǎn)hlec細(xì)胞遷移過程的影響。
3. 體外實(shí)驗(yàn)檢測fucoidan對hlec成管能力的影響。
4. 利用細(xì)胞骨架檢測fucoidan對hlec細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。
5. 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)及rt-pcr方法檢測fucoidan對hlec細(xì)胞中vegfr3蛋白及mrna的表達(dá)影響,并采用westernblot檢測vegfr3及prox1的表達(dá)水平及nf-кb/pi3k/akt信號通路的影響。
6. 利用transwell小室共培養(yǎng)方法檢測fucoidan對mhcc97h與hlec共培養(yǎng)下,hlec細(xì)胞淋巴管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響。
7.利用淋巴道高轉(zhuǎn)移hca-f細(xì)胞株建立小鼠腫瘤模型,通過對小鼠腫瘤組織的雙標(biāo)免疫熒光法檢測fucoidan對淋巴管密度(lvd)的影響,并檢測小鼠瘤重。
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