植酸酶是水解植酸及其鹽類生成肌醇和磷酸的一類酶的總稱。作為一種新型飼料添加劑，植酸酶在動物營養(yǎng)及環(huán)境保護等領域具有很大的應用潛力。綜述了植酸酶的分類、來源、生產技術、提高產率的策略、分離純化及應用等方面的研究進展，并對發(fā)展前景進行了展望。

植物組織中的磷主要是以肌醇六磷酸鈉的形式存在，難以被單胃動物吸收。而且，肌醇六磷酸分子可以螯合金屬離子，其作用相當于抗營養(yǎng)因子，抑制了營養(yǎng)的吸收。沒有被充分的利用磷，通過動物排泄進入水體最終導致水體富營養(yǎng)化。解決磷這種循環(huán)方式的根本就在于解決磷的利用問題，因而在動物飼料中添加微生物植酸酶正在逐漸被推廣和應用。

1996年FDA確認植酸酶在食品中應用是安全的，可在動物飼料中使用，植酸酶已成為第三大飼用酶。但是目前面臨的主要問題是高昂生產成本和低植酸酶產率。近年來，對植酸酶的報道有很多，主要集中在分離、鑒定、高產菌的篩選、發(fā)酵工藝及植酸酶在畜牧業(yè)生產中的應用。本文主要對目前植酸酶的上游和下游工藝水平，以及其應用進行綜述，包括發(fā)酵類型、菌株的改良等，下游技術包括分離、純化和終產品應用等。

分類

植酸酶是對可水解植酸磷釋放磷酸基團形成肌醇衍生物的一類酶的總稱，屬于磷酸單酯水解酶。廣義植酸酶包括三種類型：肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(3-植酸酶)，肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(6-植酸酶)及非特異性的正磷酸酯磷酸水解酶(酸性磷酸酶)，該類酶可將肌醇磷酸脂徹底分解成肌醇和磷酸。

Mullaney和Ullah根據(jù)植酸酶結構上的差異將植酸酶分為組氨酸酸性磷酸酶、β-螺旋植酸酶和紫色酸性磷酸酶。同時植酸酶還可根據(jù)酶的最適pH可分為酸性植酸酶、中性植酸酶、堿性植酸酶。酸性植酸酶的最適pH比較符合單胃動物胃酸性環(huán)境，因此一直是植酸酶研究的重點。例如，A. ficuum NRRL3135 分泌的酸性植酸酶由于其酶活力和耐熱性好被看成是最有應用前景的飼用植酸酶，作為首個上市的飼用植酸酶制劑，其能明顯降低豬和家禽糞便的磷水平。該酶的最適pH為2.5~5.5，因此主要應用于胃環(huán)境呈酸性的單胃動物中。中性植酸酶主要來源于芽孢桿菌屬，適合消化道呈中性的單胃動物。堿性植酸酶最早是在香蒲和百合的花粉中被發(fā)現(xiàn)的，在微生物中也有產生該類植酸酶的菌種。

2 提高植酸酶產率策略

2.1 菌種的誘變

植酸酶生產中，一些經過誘變處理的細菌如Lactobacillus amylovorus、E. coli、B. subtilis、B. amyloliquefaciens、Klebsiella spp.等已經被廣泛應用。王淘等以放射型根瘤桿菌為出發(fā)菌株，進行紫外-氯化鋰復合誘變，篩選到一株產中性植酸酶酶活性較高的菌株。該菌株產中性植酸酶活力最高達到18.49U/ml，比原始菌株提高47.68%(P<0.01)，且發(fā)酵周期也縮短了12h，同時菌株表現(xiàn)良好的遺傳穩(wěn)定性。Chelius和Wodzinski對A. niger NRRL 3135進行紫外誘變得到比野生型酶活大3.3倍的菌株，該突變菌株可以釋放60%的無機磷，但是在初步篩選中由于對植酸酶和酸性磷酸酶分辨缺乏特異性、敏感性，因而他們的研究方法具有限制性。

2.2 基因工程菌

通過基因工程技術手段構建植酸酶高產菌株已成為植酸酶研究的發(fā)展趨勢。在合適的宿主中克隆和表達植酸酶基因可以進一步提高植酸酶產量。付石軍將地衣芽孢桿菌ZJ-6編碼的植酸酶基因(PhyC)定向的插入到原核表達載體pET-30a+中，將重組質粒在E.coli中進行表達，表達產物經過親和層析純化后比活為2.87U/mg。同時他還將地衣芽孢桿菌ZJ-6中性植酸酶成熟肽基因(phyCm)以N端融合方式插入到酵母表達載體，電擊轉化入畢赤氏酵母中，發(fā)酵上清液中重組植酸酶比活為8.64U/mg，較原始出發(fā)菌株產酶活力有大幅度提高。許欽坤等根據(jù)畢赤酵母基因的密碼子選擇偏愛性，對植酸酶phyA基因進行定點突變，構建含有正突變的酵母表達載體，并通過電擊轉化進入畢赤酵母中，經發(fā)酵酶活力高達136 900U/ml。目前，植酸酶基因已經在酵母、細菌、真菌、植物等多種表達系統(tǒng)中成功表達(表 2)。

2.3 原生質體融合技術

原生質體融合對菌株的潛能提升明顯，目前已經被應用到大多數(shù)工業(yè)微生物中。但是在植酸酶研究領域，原生質體融合技術只見少數(shù)報道。謝鳳行等以產植酸酶芽孢桿菌誘變的突變株Z56和產纖維素酶芽孢桿菌復合誘變的突變株X57為親本，利用雙親滅活原生質體融合技術進行原生質體的融合,成功構建了可產植酸酶、纖維素酶的工程菌。結果通過篩選得到的兩個融合子的植酸酶產量相對較高，且植酸酶對熱的穩(wěn)定性明顯增強，90℃處理10min，剩余酶活分別為對照的73%和71%。

Gunashree和Venkateswaran[41]利用原生質體融合技術，將營養(yǎng)缺陷型黑曲霉CFR335和無花果黑曲霉SGA01原生質體經過紫外誘變處理之后進行種間融合，通過雜交獲得了高穩(wěn)定性、植酸酶產量大的菌株。由此可見，原生質體融合技術在提高植酸酶產量上是一種有效的技術手段。

3 植酸酶分離純化技術

3.1 預處理和濃縮

對于胞外酶，發(fā)酵液經離心過濾，上清液進行硫酸銨分級沉淀或超濾等法進行濃縮；胞內酶需要破碎細胞后分離，使用醇、丙酮沉淀，硫酸銨沉淀濃縮法。很多研究者通過硫酸銨沉淀法分離植酸酶，收率分別達到16.8%、50%、78%。鹽析、有機溶劑沉淀、超濾等方法都已經成功用于植物、細菌和真菌植酸酶的前期分離純化中。

3.2 層析純化

層析技術具有分離步驟少、專一性強、活力損失小的優(yōu)點，是植酸酶分離純化的主要技術。何海燕等對米曲霉發(fā)酵液經Quix-StandTM Benchto PSYSTEM纖維過濾濃縮和MonoQ10/l00GL強陰離子純化柱層析純化，兩步純化分離出米曲霉A-1的植酸酶Phy A1，相對分子質量約為45×103，純化倍數(shù)達33.4。Nabil等對B.subtilis MJA 產的植酸酶進行分離純化研究表明，DEAE瓊脂糖離子交換層析是植酸酶分離純化中最重要的步驟，該步收率達70.5%，酶純化1.9倍。而凝膠過濾層析作為純化的最后一步，最終可使酶純化4倍，收率為57.7%。

3.3 植酸酶的固定化

固定化植酸酶能夠提高酶的穩(wěn)定性和活性，解決飼料添加中酶活性降低和穩(wěn)定性不足的問題。王成波將商用植酸酶固定于殼聚糖載體上，以其為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，利用共價結合方法，對植酸酶的固定化進行探究。研究表明，植酸酶固定化條件為戊二醛濃度4%、加酶量65U/g、交聯(lián)時間5h，酶活力達到1 665U/ml。Menezes等將Aspergillus niger、Escherichia coli產的植酸酶固定于脲基化合物分子和納米黏土中，固定化之后的兩種酶在更低的酸性條件下表現(xiàn)穩(wěn)定，同時增強了它們對熱的穩(wěn)定性以及對蛋白酶的水解抵抗作用。

飼料制粒過程中的高溫降低了植酸酶的熱穩(wěn)定性，酶固定化中如何保持酶穩(wěn)定性仍然是值得深入研究的問題。

4 植酸酶的國內外市場狀況及其應用研究

植酸酶最主要的應用是作為飼料添加劑提高磷的利用率，減少環(huán)境中磷的排放。隨著植酸酶需求量的不斷增加，歐洲國家(丹麥、荷蘭等)均已經出臺規(guī)定要求加大微生物植酸酶的應用。當前，植酸酶正被大量運用到不同的生物技術領域。

4.1 植酸酶的國內外市場狀況

在國內，植酸酶產品經歷了20世紀90年代的引入期，到近年的高速發(fā)展期，市場已逐步走向行業(yè)整合期。目前生產6-植酸酶的生產廠家己從最初的幾家增至幾十多家，生產能力則從最初500多噸增加到5 000多噸以上，這其中規(guī)模較大的有四、五家，產能在2 000t以上，占國內市場份額的50%~60%。2006年植酸酶產值1.43億元，占酶制劑產值的30.8%。2007年國內植酸酶產品的銷售總量是1.2萬噸，銷售額達1.44億元(單價：12 元/kg)，其中用于配合飼料使用的為9 300萬噸。2009年，中國飼料工業(yè)發(fā)布的“十一五”發(fā)展的具體目標是：2015年，配合飼料年雙班生產能力達到1.7億噸左右，濃縮飼料產量達到3 000萬噸，添加劑預混合飼料產量達到600萬噸。而在2010年，飼用酶的市場估值已達10億美元。這預示著植酸酶作為極其重要的飼料添加劑其需求量將會持續(xù)增長。

20世紀80年代荷蘭等歐洲國家就已經開始著手對植酸酶進行研究開發(fā)。到90年代初歐盟各國、美國等發(fā)達國家就已規(guī)定養(yǎng)殖業(yè)須強制使用植酸酶，日本、韓國等國也均規(guī)定把植酸酶產品作為一種“綠色磷”取代傳統(tǒng)無機磷酸鹽。2002年國內植酸酶產品生產廠家極少，3-植酸酶產品幾乎由國外企業(yè)生產供應，并一直維持高價位銷售。2003年國內3-植酸酶產品的生產技術得到突破，使其價格從最初的300元/kg降低到80元/kg，因此對國外產品造成沖擊。2006年伴隨國內對6-植酸酶產品的規(guī)模使用，全球范圍內的3-植酸酶產品再度降價。2008年，歐洲動物添加劑和預混料協(xié)會發(fā)布消息：磷資源匱乏需加大對植酸酶的使用，這使得植酸酶產品需求量陡增。當前，全球范圍內普遍使用植酸酶，全球植酸酶市場潛力如按飼料工業(yè)產量推算，約為6.5萬噸。因而，植酸酶的使用不僅具有顯著的經濟效益，而且具有巨大的生態(tài)效益，其在飼料工業(yè)中的推廣勢在必行。而中國植酸酶產業(yè)在飼料添加劑領域的發(fā)展日漸成熟，在科研、創(chuàng)新和應用等方面也形成了較完整的體系，已經發(fā)展成為最為完善的飼用酶制劑產業(yè)。

4.2 飼料工業(yè)中的應用

植酸酶作為飼料添加劑已經廣泛應用到豬、家禽、魚飼料中，多數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，植酸酶可以釋放磷酸鹽中的磷。同時因其可提高不同營養(yǎng)物質的利用度，不同來源的植酸酶常被單獨或混合使用在飼料工業(yè)領域中。飼用植酸酶已經成為工業(yè)酶產業(yè)中增長勢頭最快的一類且正呈逐年上升之勢。

Simons等的研究已經表明在玉米、豆粕日糧中添加植酸酶，可使磷的利用率提升60％，糞便中磷的排出量減少了50%。Waldroup等報道，以豆餅為日糧的肉雞飼料中加入植酸酶，大約有50%植酸磷得以釋放。邱梅平和王恬研究在肉雞的玉米-豆粕型日糧中添加植酸酶，增加了蛋雞的腸絨毛高度、黏膜厚度，降低腸隱窩深度，進而優(yōu)化了腸道結構，增強了小腸對營養(yǎng)物質的吸收。值得注意的是，2009年由中國農業(yè)科學院生物技術研究所培育的轉植酸酶基因玉米獲得生產應用的安全證書，是世界例獲得生產應用許可的轉植酸酶基因玉米。該轉植酸酶基因玉米加工成飼料后仍然保留了大部分植酸酶活性，可分解飼料中的植酸，不但可釋放出無機磷，還可減少飼料中磷酸氫鈣的添加量，減少動物排泄物中磷的排放。

4.3 食品工業(yè)中的應用

在人類食品中添加植酸酶，市場上還沒有相關的食品開發(fā)報道。谷物中存在的植酸可抑制很多礦物的吸收，在人的小腸里植酸酶活性非常低，難以利用食物中的植酸鹽。此外，雖然人的小腸黏膜中具有植酸酶和堿性磷酸酶，但在植酸鹽的降解中卻不起作用，所以食物中的植酸酶在水解植酸鹽過程中扮演重要角色。體外模仿生理條件的實驗表明，植酸酶通過對植酸的水解可使鐵的利用率提高67％~98％。此外，植酸對鋅的利用率也有影響。在體內，鋅離子和植酸形成螯合物，降低了其利用率。谷物食糧中植酸存在是造成人體缺鋅的因素之一。因而在食品中添加植酸酶可有效增強它們的營養(yǎng)價值。Hurrell研究了在面粉中加入植酸酶應用的可能性，發(fā)現(xiàn)植酸酶可以快速降解面粉中的植酸。Tovar等在龍舌蘭酒中加入從細菌中分離的植酸酶，可以有效改善鐵和鋅的吸收。

4.4 作為土壤改良劑

對農作物而言，磷是一種基本營養(yǎng)元素，土壤中30%~80%的磷是以有機磷的形式存在，有機磷中植酸磷占了約50%，能被植物利用的非常少。很多植物可以產胞外植酸酶，如煙草、番茄、苜蓿等，可降解周圍土壤中的植酸鹽以供生長所需。在植物生長環(huán)境中加入可產生植酸酶的菌種或者添加植酸酶可增強植物對植酸磷的利用。植酸酶菌株可高效水解土壤中的植酸磷，促進了土壤中的穩(wěn)定有機磷向活性有機磷轉化。候文通等研究了轉植酸酶(phyA2)基因玉米根系分泌的植酸酶對土壤磷素的有效性和作物磷積累量的影響。實驗表明，三種轉基因玉米根系植酸酶活性遠高于陰性對照，可顯著提高根際土壤磷酸酶活性從而增加了植株對根際土壤有機磷的利用。

4.5 促進植物生長中的應用

Gujar等研究發(fā)現(xiàn)，微生物(黑曲霉)植酸酶可以減少土壤中30%的植酸，可使植酸利用度增加1.18倍。蘇毅等探究表明，施加不同量的植酸酶后，其增加了黃瓜苗的株高、玉米苗的株高及茼蒿的葉綠素含量，三種植物幼苗的生長狀況與植酸酶用量呈正相關。其中四株玉米苗處理組的株高比對照組分別增加22.50%、66.27%、27.15%、74.87%(P<0.05)，處理組的黃瓜苗株高比對照組增加30.43%，6株茼蒿中的葉綠素含量比對照組分別增加17.43%、38.98%、46.26%、58.58%、78.35%、99.04%。

4.6 其他應用領域

低磷酸肌醇在植物和動物細胞的跨膜信號傳導及從胞內動員鈣離子的過程中扮演重要角色。與化學合成相比，植酸酶在合成磷酸肌醇方面非常高效，并且專一性高、成本低，因而可應用于磷酸肌醇的生物合成中。磷酸肌醇及其同分異構體在預防糖尿病的并發(fā)癥、抗炎癥方面展示了很好的藥理特性，它還可通過控制高膽固醇和動脈粥樣硬化改善心臟病的發(fā)病癥狀。此外，Saito等研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶還可用于提高大豆中免疫性強的兩種抗原蛋白β-2伴豆球蛋白(β-conglycinin)和大豆球蛋白(glycinin)的分離效率。因此可以預見，植酸酶的應用領域將會越來越廣泛。

5 前景與展望

磷作為地球物質循環(huán)不可或缺的元素，如果不加以合理的利用和開發(fā)，勢必對食品和水資源安全產生威脅。而隨著磷酸鹽全球需求的增長，植酸酶的應用將進一步擴大。植酸酶作為環(huán)境友好型的制劑在減少磷的使用量中具有重要意義。傳統(tǒng)的植酸酶生產和純化方法有很多缺點，因而需要謀求不同的策略來發(fā)展高效的植酸酶生產工藝。例如，自動化圖像分析技術對真菌形態(tài)學的研究將有助于提升植酸酶的產率、研發(fā)新的快速經濟的酶分離純化方法、提升現(xiàn)有工藝水平。固定化技術在植酸酶儲存和使用的過程中保持酶活性仍然是很值得關注的問題。此外，應用基因工程和蛋白質工程的方法對植酸酶進行改造，也是植物酶研究中的重要方向。可以預見，隨著科技的不斷發(fā)展，植酸酶工業(yè)將展現(xiàn)突飛猛進的增長勢頭。

來源：中國生物工程雜志