Methotrexate通過主動轉運或易化擴散進入細胞和在細胞內經過多聚谷氨酸化后，會抑制二氫葉酸還原酶和二氫葉酸轉化為四氫葉酸。Methotrexate抑制嘌呤和嘧啶的從頭合成，多胺的形成以及DNA、RNA、磷脂和蛋白質的轉甲基作用。Methotrexate也會抑制胸苷酸合成酶，從而使細胞內胸苷酸不足，這可能導致抗增殖的細胞毒性作用。酶促反應被Methotrexate的多聚谷氨酸化最有效抑制的是5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)轉化為甲酰-AICAR，反應被AICAR甲?；D移酶抑制，因此導致細胞內AICAR的積累和腺苷釋放。 Methotrexate增加成纖維細胞、內皮細胞和其他細胞中腺苷的釋放。Methotrexate顯著增加腺苷的釋放，在成纖維細胞中從總嘌呤釋放(EC50, 1 nM)的4%到31%，在內皮細胞中，從24%到42%。通過暴露到受激的(fMet-Leu-Phe在0.1 μM下)中性粒細胞，Methotrexate增強的腺苷釋放，在成纖維細胞中進一步增加到總嘌呤釋放的51% (EC50, 6 nM)，在內皮細胞中增加到58%。 Methotrexate抑制免疫細胞趨藥性。Methotrexate (2.5微克/毫升)治療迅速降低多形核中性粒細胞PMNs的體外趨化反應。 Methotrexate抑制炎癥細胞因子的活性。在體外實驗中，5 nM Methotrexate抑制IL-1活性，從而抑制血管內皮細胞增殖。 Methotrexate誘導細胞凋亡。來自人類外周血液的T細胞體外活化后，Methotrexate (0.1-10 μM)會誘導其細胞凋亡。

Methotrexate顯示出體內抗炎作用。在小鼠氣囊炎模型中，Methotrexate以劑量依賴的方式使角叉菜膠處理過的空氣袋中聚集的白血球數(shù)量減少到60% (IC50 = 0.08 毫克/千克/周)。Methotrexate (0.5 毫克/千克/周)分別增加3倍的淋巴細胞中AICAR濃度，和2倍的炎性滲出物中腺苷濃度。