T4 DNA Ligase
T4 DNA Ligase即T4 DNA連接酶,可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之間以磷酸二酯鍵結合,該催化反應需ATP作為輔助因子。同時T4 DNA 連接酶可以修補雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合物上的單鏈缺刻(single-strand nicks)。
用途:T4 DNA Ligase常用于DNA片段和載體、linker或adaptor等的連接。也可以用于缺刻修復及Ligase介導的RNA檢測。
來源:本T4 DNA Ligase由大腸桿菌表達,表達基因的來源為T4嗜菌體。
活性定義:One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃ in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM (300 μg/ml)。200U等于1個Weiss unit,以Weiss unit計,本產品共200單位。
T4 DNA Ligase連接產物轉化感受態(tài)后涂板LB平板的效果參考圖1。

圖1. 本T4 DNA Ligase的連接產物轉化感受態(tài)細菌后涂板獲得的LB平板效果圖。A. 雙酶切后的載體純度:不含DNA內切酶、外切酶和磷酸酯酶,不含RNA酶,滿足常規(guī)連接反應要求。
酶儲存溶液:20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50% (v/v) glycerol。
10X Ligation Buffer:400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP。
失活或抑制:65℃孵育10分鐘可以導致T4 DNA Ligase失活;NaCl或KCl濃度大于200mM時強烈抑制T4 DNA Ligase。
包裝清單:
XY-7006-1
T4 DNA Ligase (1000U/μl)
40, 000U
XY-7006-2
10X Ligation Buffer
0.3ml
保存條件:
-20℃保存。
注意事項:
對于普通的轉化大腸桿菌的操作,不必對連接產物進行純化,連接產物可以直接用于轉化。但用電轉方法轉化大腸桿菌時,通常宜先用DNA純化試劑盒或酚氯仿抽提方法等純化DNA,然后再進行電轉。
需進行平端連接或快速連接時,推薦使用信裕生物的快速DNA連接試劑盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase可以進行平端連接,但效率較低。
普通連接反應不必進行凝膠電泳觀察。如果需要對于連接產物進行凝膠電泳觀察,推薦先在65℃孵育10分鐘使
T4 DNA Ligase失活,以避免T4 DNA Ligase和DNA結合導致的條帶位置遷移(band shift)。
本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。則可以取連接過夜的剩余連接產物再次轉化大腸桿菌。
e. 隨后即可直接取連接產物用于轉化感受態(tài)細菌。
3. Linker或RNAi片段和載體的連接:
a. 載體的酶切和純化同步驟1a和1b。
b. Linker或RNAi片段的退火可以選擇適當?shù)腄NA退火緩沖液,例如信裕生物的
Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251), 進行退火反應。
c. 長度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段,可以按照5:1至10:1的比例和載體進行連接反應。例如載體為0.03pmol,則插入片
段可以為0.15至0.3pmol。長度小于8bp的linker,比例需調整為10:1以上。
d. 除插入片段的用量外,隨后按照步驟1e-1h進行。
4. DNA自身環(huán)化的連接:
參考步驟1e,待插入片段換成適量的水即可。其余步驟按照步驟1f-1h進行。
5. 其它類型的DNA片段連接參考上述方法進行。
常見問題:
1. 連接反應后轉化效率很低或陽性克隆非常少:
a. 可能感受態(tài)細菌轉化效率太低,用質粒作為陽性對照同時檢測感受態(tài)的轉化效率。
b. 可以嘗試提高載體或插入片段的純度。對于平端連接需注意適當延長連接時間。
c. 可能載體酶切不夠充分,用未經連接的載體轉化作為陰性對照。
d. 用存放DNA的溶液進行轉化,作為陰性對照,檢測感受態(tài)細菌是否存在問題。
關鍵字: T4 DNA Ligase說明書;T4 DNA Ligase廠家
上??道噬锟萍加邢薰臼且患壹邪l(fā)、生產、銷售、服務于一體的一家生物科技企業(yè),專營生化試劑、標準品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細胞生物學,分子生物學等高生物產品??偛课挥谏虾?,并在北京、廣東,江西,吉林等全國30多個省市設有分公司和代理機構。涉及的產品被中國科學院、清華、北大、復旦,上海交大,復旦醫(yī)學院,上海中醫(yī)藥大學,華東師范大學,第二軍醫(yī)大學,曙光醫(yī)院,浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用,可靠而穩(wěn)定的質量和完善的售后服務確。