絲狀真菌線粒體DNAout

產品及特點 線粒體是重要的、負責能量產生的極其重要的細胞器。對絲狀真菌線粒體進行生化，遺傳和分子生物學研究都需要先進行線粒體純化。本產品就是基于密度梯度離心的，專門用于從絲狀真菌葉片中純化完整線粒體、再從中純化線粒體 DNA 的試劑盒。

它具有下列特點：

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 所得線粒體可用于后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白組分析、線粒體 DNA 和線粒體 RNA 純化。

3. 本產品足夠 15 次線粒體純化和 15 次線粒體 DNA 提取，每次可處理 10-20g 菌絲體，能得到 1-5 mg 左右線粒體。

4. 已經成功用于 Aspergillus candidus、Aspergillus nidulans、Magnaportheoryzae 、 Neurospora crassa 、 Penicillium chrysogenum 、 Rhizopusstononifer 等絲狀真菌。
絲狀真菌線粒體DNAout 
規(guī)格及成分 成 份 編 號 15 次大盒包裝 
絲狀真菌線粒體 DNAout 溶液 A 130831a 250 mL×2 絲狀真菌線粒體 DNAout 成分 B 130831b 150 g(干粉) 絲狀真菌線粒體 DNAout 溶液 C 130831c 120 mL 帶柄尼龍濾膜 130831d 1 個 通用線粒體 DNAout 溶液 A 130831e 10 mL 通用線粒體 DNAout 溶液 B 130831f 5 mL 使用手冊 130831sc 1 份

絲狀真菌線粒體DNAout運輸及保存 常溫運輸和保存, 保存期限一年。自備試劑 去離子水、氯仿、異丙醇、75%乙醇、TE。

使用方法注意：純化 DNA 提取用的線粒體的要求比純化功能研究用的線粒體的要求要低，但整個操作還是在冰上或者在冷室進行，所用器皿和溶液在 4℃預冷，離心要在 4℃進行，離心力以 g 而不是 rpm 計算。

一：菌絲的搖瓶培養(yǎng)

1. 使用合適的絲狀真菌培養(yǎng)基，接種孢子至終濃度為 2×10E6/mL。一般 100 mL液體培養(yǎng)基可以得到 0.8-1.2g 菌絲體，而本方法一次可以處理 10-20g 菌絲體，故一次培養(yǎng) 1-2 升。

2. 在合適的溫度（如 25℃、30℃或 37℃，根據真菌不同而不同）250rpm/min搖晃培養(yǎng) 16-20 小時。

3. 用多層紗布或多層過濾紙過濾收集菌絲，用冰浴的自備去離子水洗滌菌絲三次去除殘留的培養(yǎng)基。

4. 用吸水紙吸干菌絲的水分，稱重后立即使用。如果在-80℃或液氮長期放置，線粒體回收效率將減低。

二：線粒體粗提液的制備

5. 制備溶液 A 工作液：每次提取需 150mL 溶液 A 工作液，制備方法是將 20mL溶液 A 和 130mL 自備去離子水混合，冰上預冷即可。

6. 在 200mL 燒杯中，加入 100mL 預冷的溶液 A 工作液，再加入新制備的菌絲體，然后全部轉移到 Waring 勻漿機（家用果汁勻漿機）中，低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把菌絲按入勻漿機底部后，再低速勻漿 10 秒。注意：還可以選擇 Dounce 玻璃勻漿器，Polytron 勻漿機和研磨（加玻璃珠）等方法，但它們單次處理量一般都較小，需多份處理再匯集。

7. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，用預冷的 200 mL 量筒收集穿透液。

8. 將剩下的菌絲體轉移到 Waring 勻漿機中，再加入 40 mL 預冷的溶液 A 工作液，低速勻漿 10 秒，用上步的帶柄尼龍濾膜過濾，用預冷的 200 mL 量筒收集穿透液。注意：帶柄尼龍濾膜后可反復使用。

9. 將穿透液分到 4 個預冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個約 35 mL）。

10. 在水平轉子離心機上 4℃ 4000 g 離心 10 分鐘，小心轉移上清（含線粒體的部分）到 4 個新的離心管中。沉淀含細胞核和未裂解的細胞，可以棄之不用。如果要用于純化細胞核 DNA，則可以放-80℃長期保留。

11. 將含上清液的 4 個離心管在 4℃ 10000 g 離心 20 分鐘。

12. 每個離心管中加 2.5mL 預冷的溶液 A 工作液重懸線粒體沉淀并匯集（共約 10mL），此為線粒體粗提液。

13. 如果直接用線粒體粗提液提取線粒體 DNA，容易有細胞核 DNA 污染。具體步驟是：在水平轉子離心機上 4℃ 10000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀為線粒體，直接用于第三步的線粒體 DNA 提取。

14. 如果需要高純度、無污染的線粒體 DNA，則需要用密度梯度離心法將完整的線粒體和其他細胞碎片進一步分離。具體見下步線粒體精提液的制備。

三：線粒體精提液的制備（密度梯度離心法）

15. 制備重液和輕液：將 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 溶液 C 中，充分搖晃混勻得 10 mL 重液。將 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 去離子水中，充分搖晃混勻得 10mL 輕液。

16. 在 50 mL 塑料離心管中先加入 10 mL 重液，再在其上輕輕加上 10 mL 輕液，最后加上第 11 步所得的約 10 mL 線粒體粗提液。

17. 加平衡離心管后在水平轉子冷凍超速離心機上 4℃ 43000 g 離心 2 小時，重液和輕液間的帶為完整線粒體。

18. 用廣口吸管小心將線粒體轉移到新的離心管中，加入等倍體積的預冷的溶液 C，輕柔混勻。取少量在相差顯微鏡下檢查線粒體完整性。

19. 在水平轉子離心機上 4℃ 19000 g 離心 20 分鐘，小心將上清吸出后，線粒體沉淀可以直接用于 DNA 提取。

四：線粒體 DNA 提取

20. 將 600 uL 通用線粒體 DNAout 溶液 A 加入到上步得到的線粒體沉淀中并吹打混勻，然后轉移到 1.5 mL 離心管中。

21. 65℃放置 5 分鐘。

22. 加入 300 uL 通用線粒體 DNAout 溶液 B，震蕩混勻 10-30 秒。注意：溶液 B非常粘稠，可以將其預熱到 65℃并剪掉一截槍頭后再取。

23. 加入 200 uL 自備的氯仿，震蕩混勻 10-30 秒。

24. 12,000 g 室溫離心 3 分鐘。此時上清液將變得透明，中間層有白膜。

25. 小心轉移上清液（約 0.8 mL）到一個新的 1.5 mL 離心管中，避免觸及中間層的白膜，可留少量上清不取。

26. 加入 1 倍體積的自備異丙醇，顛倒 30 次混勻。

27. 12,000 g 室溫離心 5 分鐘，小心棄上清液。

28. 在離心管中加入 1 mL 自備的 75%乙醇，震蕩 30 秒。

29. 12,000 g 室溫離心 1 分鐘，小心棄上清液。

30. 12,000 g 室溫離心半分鐘，殘留液體將匯集在管底。

31. 用洗液槍吸棄管底殘留液（約 50 uL）。

32. 加 50-100 uL 自備的 TE 緩沖液，溶解 DNA 沉淀即得線粒體 DNA 溶液。直接取 5-10 uL 電泳檢測，其余放直接使用或放-80℃冰箱備用。