一步式染料法qRT-PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品是基于熒光染料檢測的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對靶 RNA 分子進行實時定量 RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、逆轉 錄酶、熱啟動 Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2和穩(wěn)定劑等所有實時定 量 RT-PCR 所需要的成分，用戶只需加入 RNA 模板和引物即可進行染料法實時定量 RT-PCR 反應，具有廣泛的用途。

本產(chǎn)品具有下列特點： 1. 以 2×Mix 提供，用戶只需準備模板、引物和 ROX 染料（取決于 qPCR 儀器）即可以進 行染料法實時定量 RT-PCR 實驗，非常方便快捷，降低了操作誤差。 2. 各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化，反應的靈敏度高，特異性強。靈敏度最高時可以達 到 50 拷貝/反應（跟模板質量，引物設計等相關）。 3. 靈敏度和專一性比常規(guī) RT-PCR 更高。 4. 可用于基因表達分析、SNP 分析、拷貝數(shù)分析等實驗。也可以用于定性檢測。 5. 本產(chǎn)品只能用于科研，1mL 足夠 100 次 20uL 體系的染料法 qRT-PCR 反應。 規(guī)格及成分 成 份 編 號 塑料袋包裝 2×染料法 qRT-PCR 緩沖液 190102a 500 uL（橙色蓋） 10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 190102b 100 uL（紅色蓋） 使用手冊 190102sc 1 份 

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存, 不凍融時保存期限為 12 個月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三周。 

自備試劑 RNA 模板、引物、超純水。

使用方法 1. 如果有 N 個樣品并且做定量分析，設置 N+7 個反應，多出的 7 個中，6 個是做標準 曲線的陽性對照，一個是陰性對照（NC）。在 N+7 個 PCR 管中，加入下列成分。如果是 做定性分析，則 6 個做標準曲線的樣品縮減成一個陽性對照（PC），用戶自己需要根據(jù)下 表進行適當修改（把 6 個標曲反應改成 1 個陽性對照反應）。 成分 N 個 樣品管 6 個標準 曲線管 NC 管 2×染料法 qRT-PCR 緩沖液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL 自備引物 1（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL 自備引物 2（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL N 個自備模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加 自備陽性對照模板（6 個梯度） 不加 各 1 uL（1 管 加 1 個梯度） 不加 陰性對照模板（水） 不加 不加 1 uL 自備 50×ROX I 染料 或 自備 50×ROX II 染料（見注） 各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL 10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL 補超純水到 20 uL 20 uL 20 uL 注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊為準。 1、不需要 ROX 的機型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、 Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型號的熒光 PCR 儀器 不需要加 ROX 染料，但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。 2、需要使用 ROX I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。 3、需要使用 ROX II 的機型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、 Corbett RotorGene 3000。 

2. 放入熒光 PCR 儀中進行擴增, 下表的擴增參數(shù)僅供參考，一定需要根據(jù)靶分子長度，引物 的 Tm 值等進行調節(jié)。一般選擇三步法 PCR： 步驟 反應參數(shù) 備注 逆轉錄（RT 步驟） 94℃ 30 分鐘 預變性 94℃ 2 分鐘 PCR（35-45 次循環(huán)） 94℃ 15 秒 55-65℃ 15-30 秒 在此步采集 FAM 通道的 熒光信號 72℃ 30 秒 如果引物 Tm 值接近 60℃，也可以選擇兩步法 PCR： 步驟 反應參數(shù) 備注 逆轉錄（RT 步驟） 94℃ 30 分鐘 預變性 94℃ 2 分鐘 PCR（35-45 次循環(huán)） 94℃ 15 秒 60℃ 30-60 秒 在此步采集 FAM 通道的 熒光信號 

3. 數(shù)據(jù)處理 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪 制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算 出其濃度。 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性。一般情況下，陰性對照 Ct 大于或等 于 40（閾值需要以陰性對照的 Ct 值確定，此處為便于敘述以 40 為例，具體情況很可能 閾值不一樣）。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。 對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40， 則為陽性。 

關聯(lián)產(chǎn)品 染料法 qPCR MagicMix