真菌基因組DNA提取試劑盒（目錄號(hào)：RTG2407）

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲(chǔ)存條件和效期：

室溫保存，24個(gè)月內(nèi)有效。Buffer C2于Buffer C3可能有沉淀產(chǎn)生，37℃水浴溶解后即可。RNase A常溫運(yùn)輸,-20℃保存。

● 產(chǎn)品簡介：

該試劑盒采用簡便的硅膠柱結(jié)合純化方式和獨(dú)特的溶液處理系統(tǒng)，可在60分鐘內(nèi)可處理多個(gè)100mg新鮮或30mg干燥真菌組織樣品。獨(dú)特的緩沖液與硅膠柱可以有效的去除組織裂解物種的多糖，酚類，以及酶抑制物。該試劑盒提取到的DNA可以用于PCR，Southern雜交，酶切消化等實(shí)驗(yàn)。無需使用酚氯仿等有機(jī)，可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的處理。

● 準(zhǔn)備工作：

1. 準(zhǔn)備65℃水浴；無水乙醇；異丙醇；制冰機(jī)；1.5ml離心管；2ml離心管

2. 按照標(biāo)簽所示在漂洗緩沖液PW中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液R2，緩沖液R3是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

1.樣品的處理：

A．新鮮樣品：新鮮樣品可以用液氮研磨成粉末?；蛘咴?5℃烘箱下過夜來干燥后按干燥樣品進(jìn)行操作。

B．干燥樣品：用研缽或研磨研杵研磨成粉末。

2. 小于100mg新鮮樣品或者小于20mg干燥樣品，加入600μl Buffer C1及4μl RNase A渦旋混勻。

3.65℃水浴10分鐘。孵育過程中短暫渦旋管子幾次。 

4. 加入150μl Buffer C2，顛倒振蕩混勻,冰上放置1分鐘后10,000×g下離心3min。 （離心后應(yīng)分層，如還有漂浮物，請(qǐng)延長離心時(shí)間）。

5. 小心地把上清液吸至另一新的小離心管中。注意確保不要打散沉淀團(tuán)或把組織碎片也一起轉(zhuǎn)移。

6. 加入二分之一上清體積的 Buffer C3與與等體積的無水乙醇，充分混勻。如：向300μl 上清中加入150μl Buffer C3與300μl無水乙醇。 

7. 把上述混勻的液體轉(zhuǎn)移到分離柱上。10,000×g離心1 min以結(jié)合DNA，棄去濾出液體。純化柱容量為750μl,如果混合液大于750μl,請(qǐng)分兩次過柱。 

8. 將GBC吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer（使用前須按要求用無水乙醇稀釋）至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；

9.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g離心1min,棄去流出液；

10. 將吸附柱重新套回2ml收集管中，轉(zhuǎn)速（>13.000xg）離心空結(jié)合柱1min以干燥柱子的基質(zhì)；這一步對(duì)下面的洗脫步驟至關(guān)重要。 

12. 將柱子置于1.5ml滅菌離心管，加入50-150μl65℃預(yù)熱的T洗脫緩沖液EB至柱子的膜中央。室溫靜置5min； 

13.  室溫下，離心(>13000g)1min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液。將DNA儲(chǔ)于-20℃。

對(duì)低DNA含量的樣品按如下操作：

1. 收集研磨成粉末的植物組織，新鮮組織約400mg（干燥組織約200mg），置樣品于15ml離心管中。

2. 加入9ml Buffer C1，劇烈地漩渦振蕩。

3.65℃水浴30-60min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次。

4. 加入2.5ml Buffer C2，充分混勻，3000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清到新的15ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇，3000×g離心10分鐘。

5. 倒掉上清，加入300μl的滅菌去離子水與5μl RNaseA。65℃水浴溶解DNA。

6. DNA完全溶解后，加入150μl Buffer C3與300μl無水乙醇。

7. 按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟的第七步，繼續(xù)往下操作。

● DNA濃度及純度檢測(cè)：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。