線粒體檸檬酸(Mitochondrion citric acid, MCA)含量試劑盒說明書
微量法 100 管/96 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
MCA 是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個中間產(chǎn)物,由檸檬酸合酶催化乙酰 CoA 與草酰乙酸合成,其含量 是三羧酸循環(huán)強度的主要指標(biāo)之一。 配合測定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 MCA 含量,其中(1)丙 酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度,(2)綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶 活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰 CoA 情況,(3)乙酰 CoA 含量、檸檬 酸合酶活性和 MCA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。
測定原理:
MCA 在檸檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性條件下,α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反 應(yīng),生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙;α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰,該波長下吸光度的變化程度可反映出 MCA 的含量。
自備儀器和用品:
分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、研缽、蒸餾水。
線粒體中檸檬酸提?。?/span>
稱 0.05~0.1g 樣品(建議稱 0.1g 樣本),加入 0.5ml 酸性提取液,冰上充分研磨,600g/min 4℃離心 5min; 取上清至另一 EP 管中,11000g/min 4℃離心 10min,棄上清(取 300μl 該上清液和 300μl 堿性提取液中和 后可用于細(xì)胞質(zhì) CA 含量測定);沉淀即線粒體,向沉淀中加入 0.5ml 酸性提取液,充分懸浮溶解,超聲 波破碎(功率 20%,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復(fù) 30 次),取此溶液 300μl 和 300μl 堿性提取液中和,混 勻,置冰上待測(不可用于蛋白質(zhì)含量測定)。
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