【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應(yīng)用于核酸DNA 的快速擴(kuò)增，采用通用型核酸檢測試紙條進(jìn)行檢測。

【檢測原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開發(fā)的恒溫核 酸擴(kuò)增檢測試劑，在 39℃恒溫條件下特異識別并擴(kuò)增目標(biāo)樣本的DNA片段，用通用型核酸檢測試紙條檢測判斷。

【技術(shù)原理】重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入DNA雙鏈核酸模板，在侵入位點重組酶將雙鏈打開，同時單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開始對雙鏈進(jìn)行掃描，當(dāng)引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’端，開始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級增長，完成靶標(biāo)基因的擴(kuò)增。經(jīng)過熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)探針被核酸內(nèi)切酶酶切后，與生物素標(biāo)記的引物共同擴(kuò)增形成兩端有熒光標(biāo)記及生物素標(biāo)記的片段，可用通用型核酸檢測試紙條進(jìn)行判讀。如下圖所示：

本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成反應(yīng)干粉，操作簡便，易于保存。

【引物設(shè)計與探針設(shè)計】

引物設(shè)計建議方法：RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)對引物設(shè)計的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長度在30-35nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計時主要考慮因素；最佳引物對需通過試驗優(yōu)化篩選得到，要求其擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴(kuò)增和明顯的引物二聚體。同時RAA-nfo 的下游引物 5’端用一種抗原標(biāo)記物標(biāo)記，通常為生物素。

探針設(shè)計建議方法：探針序列不與引物識別位點重疊，長度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；探針的5’端用一種抗原標(biāo)記物標(biāo)記，通常為FAM基團(tuán)或羧基熒光素；內(nèi)部含有堿基核苷酸類似物替換核苷酸（例如四氫呋喃殘基THF-有時稱為'dSpacer'）；3’末端有聚合酶延伸阻斷基團(tuán)（例如C3-spacer，磷酸基或雙脫氧核苷酸）。如下圖所示： 

建議：在開展 RAA-nfo（試紙條型）擴(kuò)增反應(yīng)之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗，以便得到較高的檢測靈敏度。

【產(chǎn)品組成】

【儲存條件及有效期】本產(chǎn)品存儲于-20±5℃、干燥、避光條件下；有效期為12 個月。

【檢測步驟】

1. DNA樣本提?。?/span>請參考傳統(tǒng)DNA提取方法或其他同效商品化試劑盒提取DNA樣本。

2. 樣本檢測

2.1 單管反應(yīng)體系（50μL）：                    推薦反應(yīng)體系（模板用量為5μL）：  

反應(yīng)干粉          1 管                          反應(yīng)干粉          1 管           

A Buffer          25 μL                        A Buffer          25 μL           

上游引物(2μM)    2.0 μL                       上游引物(2μM)    2.0 μL           

下游引物(2μM)    2.0 μL                       下游引物(2μM)    2.0 μL                 

探針(2μM)        0.6 μL                        探針(2μM)        0.6 μL

DNA樣本和水      17.9μL                        水               12.9 μL        

B Buffer          2.5μL                        DNA樣本          5 μL           

B Buffer         2.5μL 

 總體積         50.0μL           

總體積          50.0μL                                               

2.2 操作步驟：

2.2.1根據(jù)反應(yīng)數(shù)量，按照反應(yīng)體系配制含有水、A Buffer、上游引物(2μM)、下游引物(2μM) 、探針（2μM）的Mix，混合均勻后加入裝有反應(yīng)干粉的檢測單元管中；

2.2.2 向檢測單元管中加入待測DNA樣本；

2.2.3 再向檢測單元管蓋上加入2.5 μL 的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒輕甩混勻5-6次，低速離心10 sec； （注：本步驟“是否充分混勻”將決定實驗結(jié)果的重復(fù)性）

2.2.4 將檢測單元管放入39℃恒溫金屬?。ɑ蚝銣厮″仭⒑銣嘏囵B(yǎng)箱等）中，孵育30min。

2.2.5 反應(yīng)結(jié)束后，將50μL反應(yīng)體系液用無菌水或者PBS稀釋（50μL反應(yīng)體系液:300μL稀釋劑），利用通用型核酸檢測試紙條進(jìn)行檢測。推薦使用免開蓋的裝置進(jìn)行試紙條檢測，避免氣溶膠污染。

【結(jié)果分析與判定】利用通用型核酸檢測試紙條進(jìn)行結(jié)果判定。

【注意事項】

1. 在同一核酸提取方法下，不同樣品類型所提取的核酸含量和純度會有明顯差異，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不同；

2. 當(dāng)實驗室環(huán)境、試劑、儀器或配件存在陽性物質(zhì)（例如質(zhì)粒、擴(kuò)增產(chǎn)物等）污染，或樣本間存在交叉污染的情況，則會影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 務(wù)必保證試劑保存、配制或運輸?shù)卯?dāng)，否則可能導(dǎo)致試劑檢測性能下降，出現(xiàn)假陰性結(jié)果；

4. 請嚴(yán)格按照本說明書和基因擴(kuò)增實驗室的管理規(guī)范進(jìn)行試驗操作；

5. 實驗結(jié)束后，檢測過程中所產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照相關(guān)規(guī)范進(jìn)行處理。

相關(guān)產(chǎn)品：