中性轉化酶(Neutral invertase, NI)試劑盒說明書
分光光度法50管/24樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
中性轉化酶(Neutral invertase, NI)試劑盒測定意義:
蔗糖轉化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代謝關鍵酶之一。根據最適 pH,將高等植物Ivr分為酸性轉化酶(AI)和中性轉化酶(NI)兩種類型。
NI主要存在于細胞質中,負責分解細胞質中蔗糖為果糖和葡萄糖。
測定原理:
NI催化蔗糖分解產生還原糖,進一步與3,5-二硝基水楊酸反應,生成棕紅色氨基化合物,在510nm有特征光吸收,在一定范圍內510nm光吸收值與還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算NI活性
自備用品:
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體50mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入25mL試劑一充分溶解備用;用不完的試劑4℃保存;
試劑三:液體30mL×1瓶,4℃保存;
中性轉化酶(Neutral invertase, NI)試劑盒粗酶液提取:
按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟和加樣表:
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 200 | 200 |
試劑一 |
| 800 |
試劑二 | 800 |
|
混勻, 37℃準確水浴30min后,95℃水浴10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)
混勻,95℃水浴10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻, 510nm處蒸餾水調零,記錄各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式中乘以相應稀釋倍數),ΔA=A測定-A對照。
NI活性計算:
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001;x為標準品濃度(μg/mL),y為吸光值。
(1)按蛋白濃度計算:
單位的定義:37℃每mg蛋白每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。
NI活性(μg /min/mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr
(2)按鮮重計算:
單位的定義:37℃每g組織每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。
NI活性(μg /min/g 鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W
V1:加入反應體系中樣本體積,0.2mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,30min; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。
關鍵字: 中性轉化酶(Neutral invert;中性轉化酶(Neutral invert;
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