谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書

                                                       分光光度法 50管/24樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內氨同化的關鍵酶之一，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲存和運輸形式。

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒測定原理

GS在ATP和Mg²⁺存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進一步轉化為γ─谷氨酰基異羥肟酸，在酸性條件下形成的絡合物在540nm處有吸收峰，可用分光光度計測定。

所需的儀器和用品

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：30mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：12mL×1瓶，-20℃保存，臨用前37℃預熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。

試劑二：12mL×1瓶，-20℃保存，臨用前37℃預熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。

試劑三：粉劑×2瓶，-20℃保存。用時每瓶加入5mL蒸餾水充分溶解待用。

試劑四：15mL×1瓶，4℃保存。

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒樣本測定的準備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至540nm，蒸餾水調零。

2、 在EP管中加入下列試劑：

 混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴30min

混勻，25℃室溫靜置10min后，5000g，25℃離心10min，取上清液測定540nm處的吸光值A。△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒GS活力單位的計算

標準曲線：y = 0.8348x + 0.0008，R2 = 0.9999

1、血清（漿）GS活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。

計算公式：

GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷V樣÷T

=10.268×ΔA

2、組織、細菌或細胞GS活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。

GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=10.268×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。

GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T

 =10.268×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每小時產生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。

GS（μmol/h/10⁴ cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.021×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.75mL； V樣：加入樣本體積，0.175mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。